去除高丰度蛋白质后水牛卵泡液的双向电泳差异分析

以广西沼泽型水牛卵泡液为研究对象,用试剂盒免疫去除成熟及未成熟水牛卵泡液高丰度蛋白质后,采用已建立并优化的双向电泳体系对卵泡液蛋白质样品进行分离。软件分析发现,21个差异表达蛋白质与成熟卵泡液相比,10个蛋白质点表达上调,7个蛋白质点表达下调,3个蛋白质点缺失,1个蛋白质点在水牛未成熟卵泡液中特异性表达。经质谱分析,最终鉴定出3个蛋白质点:硫酸化糖蛋白、转铁蛋白和触珠蛋白。该研究成功分离并鉴定的水牛卵泡液差异蛋白质,为揭示水牛卵母细胞发育的微环境及其成熟机制提供试验依据。其中转铁蛋白对于水牛卵泡液的发育成熟具有十分重要的促进作用,而其它2个蛋白质对水牛卵泡液的成熟相关机制还尚未清楚,有待于进一步的试验研究。

东南亚养虾之现况与展望

东南亚是世界虾类养殖的重心地区,而白虾已成为世界养虾中最重要的虾种。中国为世界养虾产量最多的地区。在东南亚的养虾中,白虾的产量占总产量的比例从2004年的62%增加到2006年的76%,而草虾产量占总产量的比例则从38%减少到24%。但是印度、印度尼西亚与孟加拉国等地区的草虾产量不减反增,其中以印度为最,这与当地低密度的放养方式生产的较大体形的草虾有关。美国和日本的养虾产量由于供过于求,故虾价仍缓慢下跌,若养殖业者能把握虾价较高的季节(9月至次年1月)并生产大型虾类,则养殖利润仍高,越南的草虾即为一例。文中还提及白虾超高密度养殖的成功方法,许多地区的每季白虾生产可达40t.hm?2以上;淡水区白虾养殖可不必加以禁养,因其对环境的危害影响仍不明显。本文最后还提出发展虾类养殖的科研重点,以供有识者参考。

EGCG对水牛卵母细胞体外成熟的影响

【目的】探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对水牛卵母细胞体外成熟质量与早期胚胎发育能力的影响,为优化水牛体外胚胎生产体系及提高其体外胚胎生产效率提供参考。【方法】在水牛卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的EGCG,以排出第一极体为细胞核成熟标志,观察卵母细胞核成熟情况,检测MII期卵母细胞内活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量,并统计经孤雌激活及体外受精后早期胚胎的发育情况。【结果】在体外成熟液中添加10~20μmol/L EGCG有利于水牛卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩展,卵丘扩展指数（CEI）分别为2.49%和2.42%,卵母细胞成熟率（59.31%和50.98%）显著高于未添加EGCG的CK组（P〈0.05,下同）,MII期卵母细胞的GSH含量（3.21和3.25 pmol/枚）也显著高于CK组;添加20~30μmol/L EGCG可显著降低水牛MII期卵母细胞的ROS水平。以体外成熟培养获得的水牛MII期卵母细胞分别进行孤雌激活及体外受精,结果发现以在体外成熟液中添加10μmol/L EGCG的效果最佳,其对应的卵裂率和囊胚发育率均显著高于CK组。【结论】EGCG可用于优化水牛卵母细胞体外成熟体系,能有效提高卵母细胞的成熟率和体外发育潜力,且以水牛体外成熟液中添加10μmol/L EGCG的效果最佳。

水牛波形蛋白基因克隆及其表达分析

【目的】克隆水牛波形蛋白(VIM)基因,并明确VIM基因在水牛成熟卵母细胞(MII期)和早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况,为研究VIM在卵母细胞成熟及附植前胚胎发育中的作用机理打下基础。【方法】根据GenBank上已公布的水牛VIM基因mRNA序列设计引物,采用RT-PCR克隆水牛VIM基因,利用在线软件程序对克隆获得的水牛VIM基因进行生物信息学分析,同时以细胞免疫荧光试验检测VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况。【结果】水牛VIM基因长度为1469 bp,其编码区长度1401 bp,编码466个氨基酸。水牛VIM基因序列与人类、黑猩猩、食蟹猴、家犬、马和牛的VIM基因序列具有高度的同源性,分别为93%、93%、93%、94%、94%和99%;基于VIM基因序列构建的系统发育进化树也显示水牛与牛的亲缘关系最近。水牛VIM的分子量为53.73 k D,理论等电点(p I)5.05,主要在线粒体中表达,稳定性差(不稳定系数53.65),具有较强的亲水性,无跨膜结构,不属于分泌型蛋白,其蛋白结构以α-螺旋为主。VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中均有表达,且在成熟卵母细胞中的表达量明显高于早期胚胎。【结论】水牛VIM基因编码序列具有较高的保守性,且在水牛成熟卵母细胞(MII期)中的表达量明显高于早期胚胎(2-细胞阶段)。

牛卵母细胞及着床前胚胎发育的蛋白质组学研究进展

蛋白质组学作为一种能够全景式展示特定生物学过程的蛋白质表达谱的高通量研究手段,正被应用到越来越多的研究领域。牛的卵子发生以及着床前胚胎的生长发育都离不开蛋白质的一系列变化,通过蛋白质组学的研究手段可对牛卵母细胞成熟以及胚胎发育分子机制进行研究。前人通过构建成熟前后的卵母细胞或不同时期的着床前胚胎等的蛋白质组表达谱,来获得与卵母细胞成熟相关的标志蛋白,并对这些标志物进行验证和分析,将有利于理解牛卵母细胞成熟、体外受精及着床前胚胎发育的分子机制,为提高牛卵母细胞的成熟率以及胚胎的发育率及提高牛繁殖率等奠定基础。主要从双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、色谱技术以及质谱技术等蛋白质组学研究手段为切入点,对蛋白质组学在牛卵母细胞和着床前胚胎发育过程中的研究进展进行综述,为进一步研究牛卵母细胞及附植前胚胎提供参考。

流动人口医保现状及对长期居留意愿影响——基于京津冀流动人口动态监测数据分析

本文采用2015年国家卫生计生委流动人口动态监测数据,以京津冀流动人口为样本,重点研究京津冀地区流动人口的医保参保现状以及医疗保险因素对流动人口长期居留意愿的影响。研究发现,京津冀流动人口医保覆盖率高,但本地参保率低,且本地参保情况与流动特征和职业特征密切相关。同时,医疗保险因素对京津冀三地流动人口的长期居留意愿均有显著影响。

丽江市林下经济发展现状浅析

林下经济是一种复合高效的林业生产模式,具有投入少、见效快等特点。目前,丽江市林下经济的发展尚处于初级阶段,在其发展过程中,还存在大资源,小产业;零散开发多,统筹规划少;资金投入不足,科技研发成果转化不够;示范带动偏弱,市场体系不完善;林农注重经济效益多,生态保护意识薄弱等问题。通过分析丽江市林下经济发展现状的基础上,提出了林下经济存在的问题及今后发展的对策建议。

流动人口异地就医直接结算问题分析——以天津市为例

流动人口异地就医直接结算的实现,为解决流动人口的医疗服务均等利用奠定了良好基础,但关于流动人口异地就医问题,还存在一定的问题和挑战。文章以天津市为例,分析了流动人口异地就医直接结算存在的问题,指出当前在流动人口异地就医监管方面、医保基金支出方面以及门诊异地就医方面还存在挑战,并在此基础上探讨了应对这些问题和挑战的对策与建议。

LAMP法在水牛早期胚胎性别鉴定中的应用

【目的】建立LAMP法快速鉴定水牛早期胚胎性别体系,为预知性别水牛胚胎移植奠定基础。【方法】分别采用化学裂解法和非化学裂解法提取水牛早期胚胎DNA,对比不同方法对G3PDH基因扩增效果的影响;基于水牛SRY基因和12S r RNA基因分别设计雄性特异性引物及雌、雄性共用引物用于LAMP法胚胎性别鉴定,同时以PCR对LAMP法鉴定结果进行验证。【结果】化学裂解法对水牛早期胚胎DNA具有良好的裂解效果,其有效检出率为94.1%。优化的LAMP法对水牛早期胚胎性别鉴定的准确率与检出率均为100.0%,检测灵敏度为2×10-5 ng。LAMP扩增产物中加入1%SYBR green I,于紫外光下观察,阳性呈绿色,阴性呈淡黄色;自然光下观察,阳性呈黄色,阴性呈橙色。以LAMP法对37枚水牛IVF早期胚胎性别进行鉴定,其中雄性为28枚,雌性为9枚。PCR验证结果与LAMP法鉴定结果一致。【结论】用化学裂解法提取水牛早期胚胎DNA,再根据水牛SRY基因及12S r RNA基因设计引物进行LAMP法水牛胚胎性别鉴定切实可行。

反腐背景下的职工福利研究

反腐背景下职工福利存在违法发放、过度发放和发放不足三大问题,对我国建全薪酬福利体系形成了挑战,也损害了职工的正当权益。从问题出发,探究反腐背景下职工福利发放存在诸多问题的原因,并结合实际提出相应的措施。关于职工福利,国家已有相关的规范出台,但有关法律法规还不够健全,彻底解决反腐背景下职工福利所存在的问题,需要在做好顶层设计的基础上,将职工福利的发放固化为严格明确的法律制度。

高寒山区苹果树修剪技法

修剪在苹果栽培管理过程中十分重要,关系到果树的寿命、果子产量、果品质量。本文详细介绍不同季节和不同时期苹果树的修剪技术,为果农建设现代高效生态果园提供参考。

关于构建我国长期护理保险制度的思考

人口老龄化的加剧以及失能人数的增长,老年人的长期护理问题已经成为普遍存在的社会问题。因此,长期护理保险制度的建立具有必要性。文章根据我国现状,并借鉴国际长期护理保险的经验,提出构建我国长期护理保障制度的建议,包括参保对象、责任机构、资金筹集、资格评定以及待遇给付。

东女故都 雪梨之乡

这里，有充满传奇色彩的古东女文化，有独具特色的乾隆军事文化，有嘉绒藏族文化、宗教文化、红军长征文化……这里，有迄今已三百多年的被誉为“中国碉王”的马尔邦关碉，有自然天成高达240米的东巴石佛，有清四大皇店之一的广法寺，有万亩梨花百里红叶的绮丽景观……

京津冀医疗卫生协同发展中河北的应对策略探索

京津冀医疗卫生协同发展积极进行,也取得了一些成果。然而,差距问题也是存在的。推进京津冀医疗卫生协同发展,京津冀三地存在差异,核心是优质医疗资源分布存在差异。在京津冀医疗卫生协同发展的格局中,河北省医疗卫生发展水平较低,河北应将主动疏解非首都功能与提升河北医疗卫生发展水平有机结合起来,解决河北的诉求。

基于LC-MS/MS策略建立水牛卵母细胞蛋白质表达谱的方法研究

本研究采用了LC-MS/MS策略对如何建立水牛卵母细胞蛋白质表达谱进行了探讨,为后续研究不同时期的水牛卵母细胞和早期胚胎卵裂分化过程中蛋白质组变化建立研究平台。本实验收集水牛GV期和MⅡ期卵母细胞各500枚,去除透明带后将两个时期的细胞混合后提取蛋白质,蛋白质酶解后通过强阳离子交换色谱预分离多肽混合物,预分离后的馏分采用EASY-n LC结合LTQ-Orbitrap质谱鉴定蛋白质表达谱。通过SEQUEST检索,共鉴定出574种蛋白质,生物信息学分析表明,有明确分子功能相关的蛋白质有487种,与组成细胞成分相关的蛋白质有476种,与生物学进程相关的蛋白质有490种,初步建立了一套获得水牛卵母细胞蛋白质表达谱的方法。结果表明建立的LC-MS/MS策略方法适合于水牛卵母细胞蛋白质组学的研究,卵母细胞蛋白质表达谱数据为今后研究水牛不同时期的卵母细胞和早期胚胎卵裂分化过程中蛋白质组学奠定了方法与理论基础。

水牛孤雌激活早期胚胎蛋白质表达谱的构建及生物信息学分析

收集水牛孤雌激活后2细胞期早期胚胎500枚，利用0．1％链酶蛋白酶去除透明带后提取蛋白质，并使用胰蛋白酶进行酶解处理，再将酶解得到的多肽混合物经强阳离子交换色谱进行顸分离，预分离后所收集的馏分通过液相色谱串联质谱（LC—MS／MS）技术进行质谱鉴定，原始数据通过数据库搜索获得该时期蛋白质表达谱0通过SE-QUEST检索共得到778种蛋白，对其进行生物信息学初步分析，包括G0富集分析和蛋白互作网络分析等。结果发现，这些蛋白质主要参与氧化还原、蛋白质折叠、细胞内蛋白质运输等生物学过程，主要定位于线粒体和细胞膜上。本研究为后续以孤雌激活为研究模型探讨哺乳动物早期胚胎发育和母源性蛋白质调控机制提供了新的研究手段和方法。

水牛卵巢黄体形成和退化的蛋白质表达谱构建及生物信息学分析

本研究构建了水牛卵巢黄体形成及退化过程的定量蛋白质表达谱,从中寻找与水牛发情周期相关的重要蛋白质。为研究水牛卵巢周期性变化的分子机制提供蛋白质水平的数据支撑,进而为提高水牛繁殖效率奠定实验基础。以水牛排卵后的红体期（corpus hemorrhagicum,CH）、黄体期（corpus luteum,CL）和白体期（corpus fibrosum,CF）的卵巢作为研究对象,利用串联质谱标签（tandem mass tag,TMT）标记结合液质联用（（liquid chromatography/mass spectrometry,LC-MS/MS）的定量蛋白质组学技术,采用相关软件对得到的差异表达蛋白质进行生物信息学分析。同时对与水牛发情周期相关的重要差异蛋白质：单核巨噬细胞分化抗原（CD14）、通用转录因子Ⅱ-Ⅰ（GTF2I）、羟基类固醇（17β）脱氢酶1（HSD17B1）、U6 sn RNA相关Sm样蛋白质（LSM1）和纤溶酶原激活物抑制物（SERPINE1）进行了qRT-PCR分析验证。结果显示,共鉴定得到2 343种蛋白质,其中差异表达蛋白质有284种（差异倍数≥2.0）,初步构建了水牛卵巢黄体形成和退化的定量蛋白质表达谱。对其中的五种重要差异蛋白质（CD14、GTF2I、HSD17B1、LSM1和SERPINE1）进行qRT-PCR验证,结果有四种（CD14、HSD17B1、LSM1和SERPINE1）的qPCR结果与质谱结果相一致,仅GTF2I与质谱结果不一致,可能是由于GTF2I存在转录后调控。本研究首次从蛋白质水平对水牛卵巢排卵后的周期性变化的分子机制进行了探究,同时为其他家畜品种发情周期的研究提供了新的研究思路。

磷酸化蛋白质组学在哺乳动物精子研究中的应用

蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后最普遍、最重要的修饰之一,是生物体内一种普通的调节方式,参与调控细胞增殖、信号转导、新陈代谢、肿瘤发生等分子机能,并在精子信号转导和酶合成表达的过程中起重要作用。对精子磷酸化蛋白的研究有助于深入了解精子发生、运输、获能,以及精卵识别的调控机理。因此,在磷酸化蛋白组学的层面上研究精子的各项机能可以为雄性不育更深层的研究提供一条新的道路。