电针对脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞线粒体膜电位及凋亡的影响

目的：探讨针刺对脑缺血再灌注大鼠神经元保护作用的机制。方法：雄性SD大鼠36只，随机分为假手术组（Sham）、脑缺血再灌注组（CI／R）及脑缺血再灌注＋电针组（CI／R＋EA），每组12只。采用改良线栓法制备局灶性脑缺血（MCAO）再灌注模型。于再灌流开始后，CI／R＋EA组电针“水沟”“百会”穴，电针参数：频率2～15Hz，间断疏密波，电流强度1mA，以局部肌肉轻微震颤为度，时间30min。以罗丹明123和AnnexinV—FITC进行荧光染色，通过流式细胞仪检测细胞内荧光强度，分析脑组织细胞线粒体膜电位及凋亡发生率的变化。结果：CI／R组大鼠大脑皮层细胞线粒体膜电位明显低于假手术组（P〈0．01），细胞凋亡率显著升高（P〈0．01）；电针治疗后，线粒体膜电位升高，细胞凋亡率受到抑制，与CI／R组比较差异有显著性意义（P〈0．01）。结论：针刺治疗可明显减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，上调神经细胞线粒体膜电位水平可能是针刺抑制大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的机制之一。

局灶性脑缺血及脑缺血再灌注动物模型的制作

目的:介绍一种简便易行的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制备方法。方法:实验于2003-03/2005-03在泰山医学院神经生物学实验室完成。选择健康成年清洁级SD大鼠48只,随机数字表法分为假手术组6只,脑缺血组24只,脑缺血再灌注组18只。选择韩国产的3号圆柱形尼龙钓鱼线,直径0.2864mm,剪成长30mm若干段,将其一端粘少许用乙醇稀释合适浓度的指甲油,可形成一薄层保护膜,使插线前端光滑无锐缘,且插线前端无明显膨大,然后垂直倒放,自然凉干,于距处理端18,20mm处做黑色标记备用。自制插线从颈外动脉经颈内动脉插入,栓塞大脑中动脉,形成脑缺血状态,分别缺血30min,24h,2,3d,每个时相点6只。精确控制栓塞时间30min,拔出插线,形成脑缺血再灌注状态,分别再灌注24h,2,3d,每个时相点6只。观察动物模型的成功率,大鼠脑组织溴化2,3,5-氯化三苯基四氮唑红染色结果,光镜下脑组织尼氏小体的显示结果,脑细胞电镜观察结果,凋亡细胞观察结果。结果:①假手术组动物模型成功率为100%,脑缺血组动物模型成功率为91.7%,脑缺血再灌注组动物模型成功率为94.4%。②溴化2,3,5-氯化三苯基四氮唑红染色结果:脑缺血30min肉眼几乎分辨不出梗死灶;脑缺血24h梗死灶主要累及大脑皮质额叶颞侧及其纹状体颞侧靠近大脑皮质下的边缘部分;脑缺血2d梗死灶几乎累及缺血侧大脑半球额顶叶的全部及其纹状体的大部分;脑缺血3d梗死灶累及缺血侧的全部脑组织,甚至累及部分对侧脑组织;脑缺血再灌注显示梗死灶主要累及缺血侧大脑皮质颞侧及纹状体的颞侧部分。③尼氏染色结果显示脑缺血30min,脑组织结构无明显变化;脑缺血24h,脑损伤侧梗死区内广泛细胞坏死,部分细胞自溶;脑缺血30min再灌注24h,脑损伤侧呈现点状坏死灶;脑缺血2d,脑损伤侧呈现较多片状坏死灶;脑缺血30min再灌注2d脑细胞边界呈现毛刺样;脑缺血3d,损伤侧脑组织大片状坏死;脑缺血30min再灌注3d,脑损害趋向稳定。④电镜结果显示:脑缺血30min,神经细胞结构、层次破坏不明显;脑缺血24h,细胞内出现许多高密度中毒颗粒。脑缺血30min再灌注24h,神经细胞胞质内出现少量小的空泡及高密度中毒颗粒;脑缺血2d,很少见到能分辨的细胞结构;脑缺血30min再灌注2d,神经细胞膜性结构继续破坏,结构尚可辨认;脑缺血3d,未见形态可辨的神经细胞;脑缺血30min再灌注3d,能够分辨细胞残存的部分膜性结构。⑤脑缺血组、脑缺血再灌注组凋亡细胞高于假手术组,差异有显著性意义[分别为(75.0±2.3),(47.0±3.7),(8.0±1.2)个,F=12.3,P=0.019<0.05]。结论:该方法简便快捷(手术时间不足15min),结果可靠,稳定性好,是较理想的一种大鼠局灶性脑缺血再灌注动物模型。

一氧化氮对大鼠局灶性脑缺血再灌注所致神经细胞损伤的影响

目的:观察应用硝普钠和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME对大鼠局灶性脑缺血再灌注所致神经细胞损伤的影响。方法:取SD大鼠44只,按随机数字表法分为4组:假手术组,脑缺血再灌注组,脑缺血再灌注加侧脑室微量注射L-NAME组,脑缺血再灌注加侧脑室微量注射硝普钠组。用栓线法复制大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型,自颈内、外动脉分叉处起始,假手术组的尼龙栓子插入13mm,其余3组插入(18.0±0.5)mm造成大脑中动脉完全缺血30min,缓慢拔出尼龙栓子形成再灌注状态,L-NAME组和硝普钠组侧脑室微量注射L-NAME和硝普钠进行干预,假手术组和脑缺血再灌注组侧脑室注射等量生理盐水。于再灌注术后12,24h,2,4d分别处死动物取材,紫外分光光度计检测各脑组织一氧化氮含量,免疫组化法测脑组织NOS活性,TUNEL法检测调亡细胞。结果:脑缺血再灌注急性期(术后12h),脑组织一氧化氮含量迅速增高犤(10.14±1.97)mol/g犦,L-NAME明显降低脑组织一氧化氮的含量犤(3.86±1.35)mol/g犦,硝普钠能明显增加脑组织一氧化氮的含量犤(12.46±1.57)mol/g犦,SPSS10.0统计分析软件LSD法统计结果,各组间比较,F=24.07,P<0.05,有明显显著性意义。术后12hL-NAME抑制NOS的活性犤(16.0±1.2)个/视野犦,硝普钠组NOS的表达增强犤(62.0±4.2)个/视野犦,组间比较。

针刺对大鼠缺血再灌注后脑细胞内钙稳态的影响及脑保护的机制探讨

目的探讨针刺对抗脑缺血再灌注所致脑细胞凋亡的机制。方法采用线栓法制作SD大鼠脑缺血再灌注动物模型,于脑缺血30m in再灌注30m in时给予针刺干预,于再灌注72h处死动物取材,分别作脑细胞内游离钙、CGRP和脑细胞凋亡的检测。结果针刺干预组与单纯脑缺血再灌注组比较,脑细胞内游离钙明显降低(P<0.05),CGRP的表达明显增强(P<0.05),脑细胞凋亡数目明显减少(P<0.05)。结论针刺通过调节钙稳态及介导CGRP的分泌,减少脑缺血再灌注后脑细胞的凋亡,增强脑组织对脑缺血缺氧的耐受性。

一氧化氮对抗脑缺血再灌注所致脑细胞凋亡的机制探讨

目的探讨一氧化氮(nitric oxide,NO)对局灶性脑缺血再灌注所致神经细胞损伤的影响及影响机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组(N组)、脑缺血再灌注组(MCAO组)、脑缺血再灌注加侧脑室微量注射20 mmol/L的L-Arg 5μL组(L-Arg组)及脑缺血再灌注加侧脑室微量注射20 mmol/L的L-NAME 5μl组(L-NAME组),作脑缺血30 min,再灌注12 h2、4 h和2 d,冰冻切片,相邻切片分别作焦油紫染色、NOS免疫组化、NOS mRNA原位杂交、TUNEL法原位检测凋亡细胞。结果N组NOS的活性弱阳性表达;MCAO组术后24 h NOS的表达明显增强,与各组比较,P<0.05;L-Arg组术后12 h小血管内皮细胞出现NOS的阳性高表达,术后24 h神经细胞NOS的阳性表达最高,与各组比较,P<0.05;L-NAME组各时间点NOS活性的表达为阴性或可疑阳性,与各组比较P<0.05,NOS的活性明显受到抑制。凋亡细胞的计数结果为N组26.3±4.2个,MCAO组62±4.2个,L-Arg组40.6±2.7个,L-NAME组78.3±3.3个,P<0.05。结论适量NO可有效降低细胞凋亡的发生,减轻脑缺血再灌注所致的神经细胞的损伤。

大鼠尾核内微量注射L-精氨酸对一氧化氮合酶表达的影响

目的探讨大鼠尾核内L-精氨酸(L-Arg)、Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、亚甲基蓝(MB)等对一氧化氮合酶(NOS)表达的影响。方法动物随机分为L-Arg组、L-NAME组、MB组和生理盐水(NS)组,用免疫组织化学结合计算机图像分析的方法观察给药后6、12、24、48和72 h尾核内nNOS表达的变化。结果尾核内nNOS神经元散在表达,阳性部位主要在胞浆,神经纤维也有表达。L-Arg组nNOS神经元较正常表达增强(P<0.05),且随着时间的延长而增强,48 h达最高点。MB和L-NAME组nNOS神经元表达较正常减弱(P<0.05),随时间延长继续减弱,48 h达最低点。结论尾核内L-Arg通过NOS生成NO而发挥痛敏作用,L-NAME和MB通过抑制NOS的功能而减少NO的生成产生镇痛作用,NOS是体内合成NO的关键酶。

尾核内微量注射一氧化氮前体和供体对大鼠痛行为的影响

目的观察大鼠尾核内一氧化氮（NO）对动物痛阈（痛行为）的影响.方法以钾离子透入引起大鼠甩尾的电流强度（mA）作为痛反应指标,尾核内微量注射L-精氨酸（L-Arg）、D-精氨酸（D-Arg）、硝普钠（SNP）和血红蛋白（Hb）等,观察0～30min内大鼠痛阈的变化.结果大鼠尾核内微量注射NO的前体L-Arg和供体SNP引起明显的痛敏效应,与对照组比较有显著性差异（P〈0.01或P〈0.05）.微量注射D-Arg、Hb及SNP和Hb的混合液后大鼠痛阈变化30min内与对照组比较无显著性差异（P〈0.05）.结论中枢神经系统内NO水平升高具有明显的痛敏效应,提示大鼠脑内NO在痛觉调制的复杂过程中发挥着重要作用.

基于网络环境PBL教学模式在生理学教学中的应用研究

为完善基于问题学习(Problem-Based Learning,PBL)的教学模式,我们开展了基于网络环境下的生理学PBL教学模式的试验探索。结果显示,基于网络环境下的生理学PBL教学模式期末总成绩和半年后的相关章节成绩均显著高于其他教学模式,表明这种教学模式相较传统的PBL和授课式教学模式,可以显著提高学习效果,值得在下一步的医学教学教育中推广应用。

针刺对缺血再灌注大鼠脑细胞凋亡的保护作用及机制

目的探讨脑缺血再灌注后针刺对脑细胞线粒体跨膜电位的保护作用及保护机制。方法采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，针刺水沟、百会二穴，通过Rhodamin123荧光染色、TUNEL原位标记及电镜观察，分别于脑缺血再灌注后24h及48h检测脑细胞线粒体跨膜电位、线粒体超微结构及脑凋亡细胞的变化。结果脑缺血再灌注后Rhodamin123的荧光强度增强，术后24h是（961．27±34．22），48h是（1231．23±121．54），与假手术组（782．82±57．24）比较明显增高（P〈0．05）；针剌干预后Rhodamin123的荧光强度术后24h是（808．44±56．23），48h是（954．25±35．11），与脑缺血再灌注组比较明显下降（P〈0．05）；脑缺血再灌注后24h凋亡细胞是[（26．12±2．75）个／视野]，48h凋亡细胞是[（41．24±4．73）个／视野]，与假手术组[（3．56±0．92）个／视野]比较明显增加（P〈0．05），针刺干预后24h[（19．88±3．32）个／视野]与48h[（33．23±3．81）个／视野]凋亡细胞数量与脑缺血再灌注组比较明显减少（P〈0．05）；脑缺血再灌注后线粒体膜肿胀、崩解，内嵴断裂，中毒颗粒增加，针刺干预后线粒体的非特异性改变明显减轻。结论针刺能够稳定线粒体膜的通透性，减少线粒体跨膜电位的耗散，减少缺血再灌注后脑细胞凋亡，增加脑组织对缺血缺氧的耐受性。