EMT在肝纤维化过程中的变化和骨形成蛋白-7对其影响

目的观察EMT(上皮-间叶细胞转变)在小鼠肝纤维化进展过程中的动态变化,及骨形成蛋白-7(BMP-7)治疗后对其的影响。方法健康雄性ICR小鼠30只分为对照组(6只)、模型组(18只)和治疗组(6只),模型组再按造模不同时间点分4、8、12周3个亚组,每组6只。模型组的小鼠皮下注射四氯化碳(CCl4)制备肝纤维化小鼠模型,治疗组在造模后第8周开始腹腔注射人重组BMP-7持续4周。造模后各组小鼠下腔静脉采血测定血清检测ALT、AST和白蛋白(Alb);肝组织经HE和Masson染色后光学显微镜下观察各组病理变化;采用RT-PCR检测mRNA表达情况。结果模型组12周可见完整假小叶形成;模型组血清ALT、AST升高、Alb降低,12周时达高峰,治疗组有所缓解,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。随着纤维化的发生E钙黏蛋白的表达逐渐降低,BMP-7治疗组表达量相对于模型组明显增高(P<0.05)。α-SMA在纤维化发生过程中表达量逐渐增高,BMP-7治疗组表达量相对于模型组明显降低(P<0.05)。结论随着肝纤维化的发生发展EMT过程逐渐加强,而BMP-7能抑制EMT的发生。

Optiprep梯度离心法提取大鼠肝星状细胞的研究

目的探索SD大鼠肝星状细胞(HSCs)的提取方法,观察其生物学特性,为进一步研究它在肝纤维化和免疫应答中的可能机制奠定基础。方法依次采用前灌注液、0.15mg/ml的链霉蛋白酶E和0.5mg/ml的Ⅳ型胶原酶在体原位灌注消化肝脏。肝脏离体剪碎后,在0.3mg/ml链霉蛋白酶E、0.3mg/mlⅣ型胶原酶、0.02mg/ml DNA酶Ⅰ液中37℃振荡消化20min,低速离心(30g,5min)去除残余肝实质细胞,Optiprep密度梯度离心法获得纯化的HSCs。台盼蓝排斥试验评估HSCs细胞存活率;328nm紫外光激发HSCs自发蓝绿色荧光结合光镜鉴定细胞纯度;α-SMA免疫细胞化学方法鉴定HSCs;通过光镜观察HSCs的形态学变化。结果本方法,每只大鼠肝脏HSCs产量约8.2×106个,HSCs存活率在90%以上;原代培养24h后,纯度在85%以上;传1代后,纯度达95%以上。结论本方法简单、经济、实用,可获得较多的大鼠HSCs。

核苷和核苷酸类药物联合聚乙二醇干扰素治疗慢性乙型肝炎的研究进展

聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)与核苷和核苷酸类药物(NAs)联合应用是否能够提高慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒的疗效,已是目前CHB抗病毒治疗的热点问题。就近年来联合治疗方面的研究成果和进展作简要概述,认为PEG-IFN初始联合NAs治疗在获得HBe Ag血清学转换或者停药后应答方面的疗效并未优于PEG-IFN单药治疗,而对PEG-IFN或NAs经治患者进行序贯或联合治疗以及联合免疫生物细胞治疗是更具应用前景的联合治疗方案。

甲基莲心碱对肝星状细胞抑制增殖及促凋亡作用

目的观察甲基莲心碱对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的抑制增殖及促凋亡作用,探索甲基莲心碱抗肝纤维化的分子机制。方法体外培养HSC-T6细胞,用不同浓度甲基莲心碱作用于HSC-T6,CCK-8试剂盒(cell counting Kit-8)法检测细胞增殖抑制率,半定量反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测与凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2 mRNA的表达。结果甲基莲心碱不同浓度处理组对HSC-T6抑制增殖率均有显著统计学差异(P<0.001),呈剂量依赖性,IC50为6.820±0.415μmol/L。甲基莲心碱不同浓度处理组Bax mRNA表达上调,Bcl-2 mRNA表达下调,与空白对照组比较有统计学差异(P<0.005)。结论甲基莲心碱可抑制肝星状细胞增殖、上调Bax和下调Bcl-2的mRNA表达,通过线粒体凋亡途径促其凋亡,是一种有效作用肝星状细胞的药物,为其改善肝纤维化提供理论依据。

乙型肝炎表面抗原水平对核苷（酸）类似物序贯联合聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎患者的疗效预测

目的观察长期核苷（酸）类似物（NUC）治疗未达到慢性乙型肝炎防治指南（2010年）停药标准的HBeAg阳性CHB患者加用聚乙二醇干扰素（peg-INF）-α-2a联合治疗的疗效，并探讨HBeAg／HBsAg消失的预测因素。方法回顾性分析83例接受NUC治疗≥1年未实现病毒学或血清学应答的HBeAg阳性CHB患者，加用（peg—INF）-α-2a联合治疗48周，记录治疗12周和24周时HBV血清学标志物等指标值，停药后随访24周。以加用peg—INF的时间点定义为基线，探讨基线HBsAg水平和治疗过程中HBsAg下降程度对HBeAg／HBsAg消失的预测价值。受试者工作特征（ROC）曲线用于确定基线HBsAg水平对联合治疗后HBsAg消失的预测价值，Cox回归模型用于分析与联合治疗后HBeAg／HBsAg消失相关的因素；计算每个变量的风险比（HR），并纳入单因素和多因素分析。结果peg—INF-α-2a停药24周后，50例患者HBeAg消失，占60．2％；27例HBeAg血清学转换，占32．5％；23例HBsAg消失，占27．7％；12例HBsAg血清学转换，占14．5％。基线HBsAg％1000IU／mL的11例患者均HBeAg消失，与基线HBsAg1000-3000IU／mL（共12例，8例HBeAg消失；HR=0．215，95％CI：0．078～0．591；P=0．003）和〉3000IU／mL（共60例，31例HBeAg消失；HR=0．251，95％ CI：0．120～0．526；P=0．000）的患者比较，更易实现HBeAg消失。结论对于长期NUC治疗未取得病毒学或血清学应答的患者，加用peg—INF-α-2a时的血清HBsAg水平对HBeAg和HBsAg消失具有预测价值。基线HBsAg％1000IU／mL者，联合治疗后可获得高HBeAg和HBsAg阴转率；而HBsAg〉1000IU／mL（包括HBsAg〉3000Iu／mL）者，联合治疗12周时的HBsAg较基线下降水平可预测HBeAg／HBsAg的阴转。【

甲氧西林耐药表皮葡萄球菌的耐药基因检测及RAPD分型

目的:了解本地区耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的耐药基因存在状况,并对MRSE菌株进行基因同源性分型,为临床治疗及感染控制提供依据。方法:应用聚合酶链反应(PCR)对39株MRSE的6类耐药基因进行检测,并采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对菌株进行基因同源性分型。结果:39株MRSE的mecA、ermB、ermC、msrA、tetM、tetK、Aac(6')/aph(2″)、aph(3')-III和mupA耐药基因的阳性率分别为100.0%(39/39)、12.8%(5/39)、94.9%(37/39)、43.6%(17/39)、5.1%(2/39)、2.6%(1/39)、82.1%(32/39)、25.6%(10/39)和12.8%(5/39),未检测出er-mA、tetO、tetL、ant(6')-I、vanA和vanB耐药基因;RAPD将39株MRSE分为11型,其中A型占48.7%(19/39)。结论:本地区的MRSE存在高比例的mecA、ermC、Aac(6')/aph(2″)耐药基因,RAPD分析提示MRSE的流行株以A型为主。

kielin／chordin样蛋白在肝纤维化模型中的动态表达及骨形成蛋白-7干预后的表达变化

目的观察kielin／chordin样蛋白（kcp）在肝纤维化小鼠模型中的动态表达及骨形成蛋白-7（BMP-7）干预对其表达的影响，探讨治疗肝纤维化的新靶点。方法健康雄性ICR小鼠50只，分为正常对照组（10只）、模型组（30只）和BMP-7干预组（10只），模型组再按造模不同时间点分4、8、12周3个亚组，每组10只。模型组小鼠皮下注射四氯化碳制备肝纤维化小鼠模型，BMP-7干预组在造模后第8周开始腹腔注射人重组BMP-7，持续4周。造模后各组小鼠下腔静脉采血测定血清ALT、AST和Alb；肝组织经HE和Masson染色后光学显微镜下观察各组病理变化；采用RT-PCR、免疫组织化学和Western印迹法分别检测各组kcpmRNA及蛋白表达情况。各组间均数比较采用单因素方差分析。结果模型组血清AI。T、AST升高，Alb降低，12周时达峰值，BMP-7干预组有所缓解，各组间比较，差异有统计学意义（F值=23．501、34．600、16．244，均P〈0．05）。正常对照组kcpmRNA和蛋白表达很低，模型组则逐渐升高，BMP-7干预组有所缓解，差异有统计学意义（F值=30．362、10．727，P〈0．01或0．05）。kcpmRNA表达水平与转化生长因子81（TGF-131）、BMP-7mRNA表达水平均呈正相关（r=0．760、0．769，均P〈0．05）。结论BMP-7能改善小鼠肝纤维化；kcp可能参与肝纤维化发生发展过程，有望成为肝纤维化治疗的新靶点。

甲基莲心碱对转化生长因子-β1诱导的肝星状细胞增殖及gremlin表达的影响

目的观察甲基莲心碱对转化生长因子（TGF）-β1诱导的肝星状细胞（HSC）增殖及gremlin、TGF-β1、α-平滑肌动蛋白（α-SMA）表达的影响。方法体外培养HSC-T6细胞，分成正常对照组、TGF-131干预组、TGF一81＋甲基莲心碱分别为2．0、4．0、8．0mmol／L联合干预组，细胞计数试剂盒（cCK）一8检测细胞增殖抑制率，半定量RT—PCR．Western印迹法分别检测HSC—T6细胞gremlin、TGF-β1、α-SMAmRNA及蛋白表达。组间差异采用单因素方差分析，方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者采用DunnettT3检验，相关性采用Pearson直线相关分析。结果与正常对照组相比，TGF-β1对HSC—T6细胞增殖无影响（P〉0．05），但能上调gremlin、TGF-β1、α-SMAmRN『A及蛋白的表达，差异有统计学意义（P〈0．05）。与TGF-β1干预组相比，甲基莲心碱能抑制HSC—T6细胞增殖，呈时间、剂量依赖性，以TGF-β1＋甲基莲心碱8mmol／L联合作用72h对HSC—T6细胞抑制最显著（F=2817．056，P〈O．01），抑制率为（69．08±1．05）％。甲基莲心碱可不同程度抑制gremlinmRNA及蛋白的表达，TGF-131＋8mmol／L甲基莲心碱联合干预组表达量最低，为0．2483±0．0084、0．9307±0．0224。与TG-β1干预组比较，gremlin、TGF-β1、α-SMAmRNA表达量随甲基莲心碱浓度的增加呈递减趋势（F=16．800、209．246、70．486，均P〈0．05），蛋白表达量也呈递减趋势（F一56．588、12．550、32．141，均P〈0．05）。gremlin、TGF-β1、a—SMA的表达呈两两正相关（P〈O．05）。结论甲基莲心碱能有效作用于HSC，gremlin可能参与肝纤维化的发生发展，有望成为肝纤维化治疗新靶点。