细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体的构建与鉴定

目的 :构建并鉴定细胞因子GM CSF和结核杆菌Ag85A融合表达质粒 ,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法 :用PCR方法从pc mGM CSF质粒中扩增出GM CSF ,构建于pcDNA3 1质粒上 ,成为pcDNA3 1 GM CSF。从结核杆菌H3 7Rv基因组中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pcDNA3 1 GM CSF上 ,将基因GM CSF的 3′端与基因Ag85A的 5′端直接连接构建融合表达质粒pcGM85A。结果 :经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。结论 :细胞因子GM CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体构建成功 ,为研制新型结核病基因疫苗奠定了基础。

结核杆菌Ag85A和mGM-CSF共同表达载体的构建与CTL活性的诱导

构建、鉴定结核杆菌Ag85A和细胞因子GM CSF共同表达质粒 ,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。先从质粒pBSby5中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pIRES上成为pI85A ,用PCR方法从pc mGM CSF质粒中扩增出mGM CSF ,构建于pI85A质粒上 ,成为共同表达质粒pI85AGM。然后转染 772 1细胞 ,进行蛋白的表达和鉴定。结果经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。通过RT PCR、SDS PAGE、Westernblot检测证实Ag85A与mGM CSF基因的转录和蛋白表达正确。Ag85A与mGM CSF免疫组小鼠的CTL活性明显增强。表明细胞因子GM CSF和结核杆菌Ag85A共同表达载体构建成功 ,并能诱导小鼠的CTL活性 。

基于甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物水凝胶三维培养卵巢癌细胞的研究

目的：验证卵巢癌SKOV-3细胞在自制甲基乙烯基杉马来酸酐共聚物水凝胶中培养形成的3D模型。方法：通过SKOV-3细胞生长曲线、迁移和侵袭能力、耐药实验等，对比自制的水凝胶培养基与市售BME胶和胶原蛋白胶I胶培养基对SKOV-3细胞若干特性的影响。结果：SKOV-3细胞在自制水凝胶TZ028和TZ029培养基第10—15天时，为3D细胞培养最佳时期；在Transwell实验中表现出与胶原蛋白I胶相似的细胞侵袭力，并优于BME培养基；在紫杉醇耐药实验中形成细胞3D结构耐药性要高于2D细胞培养（P〈0．05）；与BME和胶原蛋白I胶培养基相比，该细胞对相同浓度下紫杉醇耐药性差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：自制的甲基乙烯基彬马来酸共聚物和交联剂聚乙二醇交联反应形成的3D培养基质水凝胶，与商品化BME胶和胶原蛋白胶I胶培养基相比，具有类似的细胞培养功能。

结核杆菌DNA疫苗研究近况

当今结核病成为一种严重的传染性疾病 ,现正在研究新型DNA疫苗以取代BCG。目前研究以Antigen85、hsp6 5 ,以及结核杆菌培养过滤液中的分泌蛋白ESAT 6和MPT 6 4编码基因构建的DNA疫苗中取得一定进展 ,并与BCG联合使用 ,会大大加强免疫效果 。

卵巢癌干细胞对5种化疗药物的耐药性及其机制

目的探讨卵巢癌干细胞(Ovarian Cancer Stem cells,OCSCs)针对化疗药物耐药的作用机制。方法通过免疫磁选方法分离和纯化OCSCs,对比普通卵巢癌细胞(EOC),观察在紫杉醇、卡铂、顺铂、5-FU、阿霉素5种化疗药物作用下OCSCs耐药的情况。通过定量PCR,分析EOC与OCSCs中ABCG2、ABCB1、Nanog、MMP-2和MMP-9基因的表达水平。结果从HO8910细胞分离的CD44+CD117+细胞,对卡铂、顺铂、紫杉醇、阿霉素和5-FU等化疗药物的耐药性明显强于HO8910细胞(P<0.05)。定量PCR检测发现CD44+CD117+细胞中ABCG2、ABCB1、Nanog、MMP-2和MMP-9基因的表达显著高于HO8910细胞(P<0.05)。结论与EOC相比,OCSCs对多种化疗药物的耐药性更为明显的机制可能与其较高水平表达ABCG2,ABCB1,Nanog,MMP-2和MMP-9基因有关。

小鼠白细胞介素21 cDNA的克隆及真核表达质粒的构建

目的 :克隆小鼠白细胞介素 2 1(IL 2 1)基因 ,构建真核表达质粒 ,用以进行肿瘤的基因治疗。方法 :用RT PCR法 ,从ConA活化的小鼠T细胞中扩增IL 2 1cDNA ,克隆入哺乳动物细胞高效表达质粒 pcDNA3.1中 ,构建重组mIL 2 1真核表达质粒。重组体用载体上的通用引物和PCR下游引物为测序引物 ,鉴定克隆的正确性。将已鉴定的重组质粒用脂质体法转染Sp2 / 0细胞 ,用RT PCR法鉴定转染细胞中IL 2 1基因的表达 ,用MTT比色法检测表达的mIL 2 1诱导的NK细胞杀伤活性的增强。结果 :正确构建了重组真核表达质粒 pcD NA3.1/mIL 2 1,并在转染的细胞中检测出IL 2 1的表达 ,表达的mIL 2 1可在体外增强NK细胞的杀伤活性。结论 :成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/mIL 2 1,为进一步在肿瘤动物模型中进行IL 2

B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗安全性及抗肿瘤效应研究

目的:评估B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗用于C57BL/6小鼠的安全性及其诱导的抗肿瘤免疫效应。方法:应用免疫荧光、FCM检测瘤苗细胞ESAT-6-GPI的表达情况;以Western blot方法检测瘤苗细胞IL-21的表达情况;动物实验检测瘤苗体内应用的安全性;制备荷瘤鼠术后免疫模型,评价瘤苗免疫效果。结果:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞表面有靶抗原ESAT-6-GPI表达,并分泌IL-21。于C57BL/6小鼠皮下接种2×105个B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞,60天内未见致瘤,但能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。结论:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗致瘤性明显下降,低剂量应用具有安全性,能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。

肿瘤抗原P1A与细胞因子mGM-CSF共表达载体的构建和表达

目的 :构建并鉴定细胞因子mGM CSF和肿瘤特异抗原P1A共表达载体 ,为研究新型的肿瘤疫苗提供新的策略。方法 :以PCR方法从pCI neo P1A中扩增出P1A编码基因片段 ,构建于pRSC质粒上 ;再从pORF mGM CSF中扩增出mGM CSF基因片段 ,插入pRSC P1A重组质粒P1A基因的上游。以酶切和DNA测序进行鉴定。并将鉴定过的重组质粒以脂质体法转染 772 1细胞 ,用RT PCR法鉴定转染细胞中P1A基因和mGM CSF基因的表达。结果 :经酶切鉴定和DNA测序证实mGM CSF和P1A重组质粒构建正确 ,并在转染此质粒的 772 1细胞中检测出了P1A和mGM CSF基因的表达。结论 :成功构建mGM CSF和P1A的共表达载体 。

靶向上皮性卵巢癌SKOV3细胞ZEB1-shRNA重组体构建及功能研究

目的:利用RNA干扰技术,降低人上皮性卵巢癌SKOV3细胞中锌指增强子结合蛋白1(ZEB1)基因的表达,观察ZEB1低表达对SKOV3细胞的生长影响。方法:用pSUPER-EGFP1载体构建针对人ZEB1基因的干扰质粒shZEB1,脂质体转染SKOV3细胞,G418筛选稳定转染细胞株,通过RT-PCR和Western blot检测ZEB1在SKOV3细胞中表达。用克隆形成、划痕试验、RT-PCR和致瘤试验分别检测转染细胞克隆能力、迁移力、miR-200c表达水平和在裸鼠的致瘤性。结果:成功构建shZEB1,稳定转染细胞株shZEB1-SKOV3内ZEB1表达下降,导致shZEB1-SKOV3细胞miR-200c表达增高,克隆能力、迁移力及致瘤性下降。结论:用RNA干扰技术可靶向降低卵巢癌细胞株SKOV3内ZEB1的表达,使其致瘤性降低,提示ZEB1可作为分子靶点用于上皮性卵巢癌靶向治疗。

伏格列波糖中有机溶剂残留量的毛细管GC测定

建立了毛细管GC法测定伏格列波糖中11种有机溶剂的残留量。以50%DMF水溶液为溶剂,采用DB-624弹性石英毛细管柱,程序升温,FID检测器,载气为氮气。

GPI修饰的ESAT-6核酸疫苗的构建及其免疫功能初探

目的构建糖基化磷脂酰肌醇(GPI)修饰的结核杆菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)核酸疫苗,初步分析其免疫功能。方法利用重叠PCR法构建pIRES-ESAT-6-gpi重组体,转染B16F10细胞,G418筛选阳性克隆,用RT-PCR、免疫荧光检测转染细胞的ESAT-6抗原表达情况;采集ESAT-6核酸疫苗免疫鼠血清,分别检测抗体滴度和CDC效应,免疫磁珠法分选CD4+和CD8+T细胞,CFSE/7-AAD细胞毒实验分析CTL细胞毒活性。结果测序正确的重组体pIRES-ESAT-6-gpi转染细胞后,ESAT-6表达于细胞膜表面。ESAT-6核酸疫苗免疫血清和CD8+T细胞分别通过CDC效应和细胞毒作用杀伤膜表达ESAT-6的B16F10细胞。结论构建的GPI修饰的ESAT-6核酸疫苗能够诱导免疫鼠产生体液和细胞免疫反应,杀伤膜表达ESAT-6的B16F10细胞,为进一步基于该法构建B16F10瘤苗的抗肿瘤免疫效应及机制研究奠定了基础。

mIL-21基因治疗小鼠肿瘤及其机制的初步研究

建立小鼠Sp2/0皮下肿瘤模型,以我们构建并鉴定过的真核表达质粒peDNA3.1/mIL-21在瘤体内直接注射,考察mIL-21基因治疗对小鼠Sp2/0肿瘤的疗效。结果显示pcDNA3.1/mIL-21质粒治疗对小鼠皮下Sp2/0肿瘤有一定的生长抑制作用,CTL和NK细胞毒活性明显增强,IFN-γ分泌升高显著,但抗体无明显升高。表明mIL-21基因治疗的抗肿瘤效应,可能和细胞免疫功能增强有关。

mGM-CSF重组质粒的构建、表达及活性鉴定

目的 构建pc mGM CSF重组质粒载体 ,为mGM CSF基因治疗肿瘤的研究奠定基础。方法 采用RT PCR方法从小鼠脾脏中获得目的基因mGM CSF ,克隆于 pcDNA3 .1/Myc His( -) (A )质粒上 ,成为pc mGM CSF ,用PCR、酶切进行鉴定 ,然后用脂质体转染小鼠骨髓瘤细胞SP2 / 0 ,用G 418筛选后通过RT PCR和SDS PAGE鉴定 ,将转染SP2 / 0上清加入NFS 60细胞 ,检测蛋白活性。结果 重组质粒中含有mGM CSF基因 ,在SP2 / 0中有表达 ,且表达产物能分泌到肿瘤细胞外 ,分泌到细胞外的产物用mGM CSF依赖株NFS 60细胞检测证明具有生物学活性。结论 成功构建含mGM CSF真核表达重组质粒 。

结核DNA疫苗免疫策略研究进展

近年来,结核DNA疫苗的研制得到飞速发展,在传统结核DNA疫苗的基础上构建新型DNA疫苗以及基于结核DNA疫苗的PrimeBoost免疫策略的研究成为热点,新的接种途径及接种技术有助于提高DNA疫苗在试验动物的免疫保护作用,同时对结核DNA疫苗的安全性也不可忽视。

ABCG2单抗联合NPs-PTX体外抑制MMCSCs作用初探

目的:研究ABCG2单抗联合Fe3O4纳米紫杉醇(NPs-PTX)对人多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)癌干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)体外抑制作用。方法:经免疫磁珠分选方法,从人MM细胞系NCI-H929和RPMI8226细胞中分选出CD138-CD34-细胞,采用CCK-8检测、流式细胞仪分析法观察ABCG2单抗联合NPs-PTX对MM CSCs增殖、迁徙的抑制作用和其对凋亡及细胞周期的影响。结果:ABCG2单抗联合NPs-PTX能有效的抑制MM CSCs增殖,抑制率达80%,与单用NPs-PTX比较(55%),差异有显著性(P<0.05);ABCG2单抗联合NPs-PTX组迁徙率为0.6%,较NPs-PTX组(1.7%),差异有极显著性意义(P<0.01);ABCG2单抗联合NPs-PTX能有效诱导MM CSCs凋亡,凋亡率达43.15%,与单用NPs-PTX比较(18.35%),差异有显著性(P<0.05),并使MM CSCs发生G/M期阻滞。结论:ABCG2单抗联合NPs-PTX具有体外抑制人MM CSCs作用,其机制可能与其通过诱导细胞凋亡,发生细胞周期阻滞有关。

利用巢式PCR扩增目的基因构建hsa-miR-200c真核表达载体及鉴定

目的用巢式PCR从人类基因组获取miR-200c及侧翼序列,构建hsa-miR-200c重组体,转染卵巢癌细胞系SKOV3,检测其对E-钙粘蛋白表达的影响,为miR-200c对肿瘤细胞基因表达调控奠定基础。方法据microRNA数据库设计人miR-200c及侧翼引物,提取人细胞基因组进行PCR和巢式PCR获得miR-200c及侧翼共307个碱基序列,连接到pIRES2-EGFP载体中,测序鉴定后再将的miR-200c基因经慢病毒载体系统转染SKOV3细胞,检测miR-200c过表达对卵巢癌细胞E-钙粘蛋白表达的影响。结果成功扩增出miR-200c及侧翼共307个碱基序列,构建的重组体pIRES2-EGFP-miR-200c测序正确,转染SKOV3细胞后miR-200c过表达引起E-钙粘蛋白表达增多。结论巢式PCR技术能有效地从基因组中扩取miR-200c及侧翼片段用以构建miR-200c表达载体,miR-200c过表达可引起卵巢癌SKOV3细胞E-钙粘蛋白表达增多,可能导致细胞间黏附性增高。

GM-CSF基因免疫治疗小鼠骨髓瘤的实验研究

目的:探讨mGM-CSF基因免疫小鼠是否可以诱发小鼠对肿瘤的免疫应答。方法:用SP2/0肿瘤细胞皮下接种Balb/c小鼠建立肿瘤动物模型,再以皮下或肌肉注射空质粒或重组质粒4次,共400μg。8周后观察小鼠的抑瘤率、肿瘤质量、肿瘤组织淋巴细胞的浸润情况,检测血清中IFN-γ和IL-2浓度,MTT法体外检测CTL、NK细胞活性。结果:基因免疫Balb/c小鼠8周后,重组质粒皮下注射组肿瘤质量[(0.880±0.405)g]轻于对照组[(1.548±0.221)g,P<0.01];重组质粒肌肉注射组肿瘤质量[(0.378±0.411)g]明显轻于对照组[(1.554±0.249)g,P<0.001];重组质粒肌肉注射组肿瘤组织可见淋巴细胞浸润;IFN-γ和IL-2的浓度及CTL、NK细胞活性显著高于对照组。结论:GM-CSF基因免疫能诱发小鼠抗肿瘤作用,肌肉注射比皮下注射效果好。

氨氯地平联合辛伐他汀对中老年高血压合并颈动脉斑块血压昼夜节律变化的影响及其机制研究

目的:研究氨氯地平联合辛伐他汀对中老年高血压合并颈动脉斑块血压昼夜节律变化的影响及其机制。方法:选取我院2013年7月-2015年6月中老年高血压合并颈动脉斑块病患者120例,将其随机分为实验组与对照组,各60例。在其他治疗措施相同的基础上,对照组仅采用氨氯地平治疗,实验组采用氨氯地平联合辛伐他汀片治疗方案。观察两组间的疗效及相关指标差异。结果:对照组治疗前、后血HDL-C、LDL-C、TC、TG等指标差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,实验组上述指标较对照组明显改善(P<0.05);治疗后,两组患者颈动脉IMT均较治疗前明显降低,且实验组明显低于对照组(P<0.05)。实验组治疗后睡眠期间血压下降率大于日间血压的10%,较治疗前显著降低且实验组低于对照组(P<0.05)。结论:苯磺酸氨氯地平与辛伐他汀联合治疗中老年高血压合并颈动脉斑块患者可有效调节血脂、延缓颈动脉IMT增厚,恢复血压昼夜节律,从而减少发生心血管事件的风险。

天冬酰胺内肽酶敲除协同阿可拉定有效抑制乳腺癌骨转移

目的研究天冬酰胺内肽酶敲除和阿可拉定对乳腺癌骨转移的影响。方法分别用野生型、天冬酰胺内肽酶敲除型的小鼠进行心脏注射造模,用阿可拉定进行治疗,Micro-CT分析检测,观察乳腺癌骨转移造成的骨腐蚀情况;蛋白免疫印迹实验检测相关指标变化。结果单纯敲除天冬酰胺内肽酶的小鼠可以轻微缓解乳腺癌的骨转移,联合阿可拉定用药以后可以有效缓解乳腺癌骨转移,两者共同影响信号传导及转录激活蛋白-3、糖原合成酶激酶-3β、β-连环蛋白信号通路。结论天冬酰胺内肽酶敲除协同阿可拉定用药可有效缓解乳腺癌骨转移。