孕酮诱导的蜕膜蛋白Depp在哺乳细胞株的转染表达与定位

目的将孕酮诱导的蜕膜蛋白Depp基因构建到pC-DGFP表达载体中,分析其在哺乳细胞株中的表达和定位情况。方法用PCR方法扩增Depp全长序列,插入真核表达载体pCDGFP中,将构建好的质粒转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位;转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,利用GFP抗体进行Western blot检测。结果荧光显微镜观察表明,Depp蛋白主要分布在COS7细胞的胞质内,在细胞核周呈斑块状分布,在细胞核未见到明显表达,在HEK293T细胞中能有效表达。结论成功构建pCDGFP-Depp表达载体并确定Depp蛋白在哺乳细胞株中能有效表达。

人COX6B1在哺乳动物细胞株中转染表达与定位的初步研究

目的构建带FLAG标签的人野生型细胞色素氧化酶亚基COX6B1表达载体,转染至HEK 293T、COS7细胞观察COX6B1蛋白在细胞内表达与定位。方法以含人COX6B1全长cDNA序列的质粒为模板,通过上游带有FLAG标签的引物,PCR方法扩增出COX6B1全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3.1中构建pCDNA3.1-FLAG-COX6B1表达载体。将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。结果成功构建了pCD-NA3.1-FLAG-COX6B1表达载体,其在HEK 293T细胞中能有效地表达;在COS7细胞中呈斑点状分布,且主要在胞质内分布,细胞核中未见其明显表达。结论 COX6B1在HEK293T、COS7细胞中均有表达,且主要分布在胞质内,这为进一步了解COX6B1的功能提供了一定的基础。

人cystatinB基因在哺乳动物细胞株中的定位与表达

目的用基因克隆方法构建带FLAG-tag的人cystatinB真核表达载体,用其转染COS-7和HEK 293 T细胞观察cystatin B在增殖细胞内的定位;转染HEK 293 T细胞检测其表达。方法设计带FLAG-tag的引物,以人cystatin B全长cDNA序列的质粒为模板,PCR法扩增cystatin B全长序列,然后插入pCDNA 3中构建pCDNA 3-cystatin B-FLAG(CSTBF)质粒;脂质体法转染至COS-7、HEK 293 T细胞,荧光显微镜下观察其在细胞内定位;转染至HEK 293 T细胞,提取细胞总蛋白进行Western blot。结果正确构建了pCD-NA 3-cystatin B-FLAG质粒;定位实验表明在COS-7和HEK293 T细胞中,cystatin B主要分布在细胞核内,核膜处更集中,胞浆内也有广泛分布;Western blot结果表明该质粒能在细胞中有效表达。结论该研究结果为了解cystatin B在细胞内与其他蛋白质相互作用及功能提供了一定的基础。

PAM14缺失突变体在哺乳动物细胞中的表达和定位

目的构建带HA标签(标签序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇)的PAM14缺失突变体PAM14-N和PAM14-C的真核表达载体,将其分别转染至COS7细胞中观察PAM14-N和PAM14-C蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其是否表达。方法以含人PAM14全长cDNA序列的质粒pACT2-PAM14为模板,PCR法扩增PAM14-N-HA,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后插入真核表达载体pCDNA3.1中,同理构建pCDNA3.1-HA-PAM14-C,将重组表达质粒pCDNA3.1-PAM14-N-HA和pCDNA3.1-HA-PAM14-C分别转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。转染至HEK293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测。结果经测序鉴定,成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-PAM14-N-HA和pCDNA3.1-HA-PAM14-C,转染后荧光显微镜观察PAM14-N在COS7细胞中主要定位于细胞核,PAM14-C定位不明显;经Western blot检测PAM14-N在HEK293T细胞中能够有效表达,PAM14-C无表达。结论实验结果确定了PAM14功能最小区域及PAM14-N的定位和表达,为进一步了解PAM14的功能奠定了基础。

人脂肪间充质干细胞条件培养基冻干粉促进皮肤成纤维细胞迁移、细胞外基质合成和抑制巨噬细胞炎症

目的探讨人脂肪间充质干细胞条件培养基冻干粉(hADMSCs-CMLP)对成纤维细胞(HFF-1)迁移、细胞外基质合成水平的影响,以及对小鼠巨噬细胞(Raw264.7)炎症因子释放的影响。方法收集人脂肪间充质干细胞P3代细胞条件培养基上清液,经冷冻干燥后,获得冻干粉制剂。使用前用去离子水溶解,添加到人成纤维细胞HFF-1和小鼠巨噬细胞Raw264.7培养基中。用细胞划痕实验筛选冻干粉的浓度,用活细胞工作站和transwell方法检测人成纤维细胞迁移和细胞增殖情况;qRT-PCR法检测成纤维细胞细胞外基质蛋白纤维粘连蛋白、弹性蛋白、I型胶原蛋白、MMP-1的mRNA水平变化;ELISA法测定巨噬细胞Raw264.7炎症因子TNF-α、IL-6释放情况。结果分离传代培养后,得到的P3代hADMSCs呈长梭形漩涡状并贴壁生长,有立体感,其间充质干细胞表面标志性抗原CD73、CD90、CD105阳性表达率均大于95.00%,CD34、CD45、HLA-DR均小于2.00%;诱导培养21~28 d后出现明显的成脂、成骨和成软骨细胞特性;细胞划痕实验显示50%的hADMSCs条件培养基冻干粉对成纤维细胞划痕修复效果最好。HFF-1细胞与hADMSCs条件培养基冻干粉共培养24 h,HFF-1细胞迁移率增加了近4倍(P<0.001);qRT-PCR结果显示,hADMSCs条件培养基冻干粉共培养处理48 h,HFF-1细胞纤维粘连蛋白、弹性蛋白、I型胶原蛋白基因表达相对于对照组分别上调了2.07倍(P<0.001)、3.92倍(P<0.001)和2.37倍(P<0.001),MMP-1基因表达水平显著降低了2.98倍(P<0.001);hADMSCs条件培养基冻干粉与LPS刺激的小鼠巨噬细胞(Raw264.7)共孵育24 h,与LPS组相比,TNF-α下降了20.7%(P<0.01),IL-6下降了83.9%(P<0.001)。结论hADMSCs条件培养基冻干粉能够显著促进成纤维细胞迁移,同时促进成纤维细胞的纤维粘连蛋白、弹性蛋白、I型胶原蛋白转录水平升高;hADMSCs条件培养基冻干粉还能显著抑制TNF-α和IL-6炎性因子的分泌。因此,hADMSCs条件培养基冻干粉在创伤修复、组织工程和美容抗衰领域具有一定应用潜力。