16S rRNA基因序列用于临床非典型细菌的补充鉴定

目的利用16SrRNA基因序列分析方法鉴定临床非典型细菌,为临床细菌分类鉴定新方法提供补充。方法提取细菌的DNA,自行设计引物并利用PCR技术扩增细菌16SrRNA基因片段,并对扩增片段进行序列测定,利用Blast等在线软件进行序列同源性分析。结果在32株临床非典型细菌中,3株细菌可以鉴定到“属”,29株细菌可以鉴定到“种”,其中2株可以鉴定到“亚种”。结论16SrRNA基因序列分析法是有效的病原细菌分类鉴定的补充。

青海血蜱重组蛋白Hq001的结构预测与原核表达

目的对从青海血蜱唾液腺cDNA文库中克隆出的1个新基因Hq001编码的蛋白质进行三维理论模型预测,并评估其与Kunitz型蜱源抗凝血蛋白质之间的关系。方法构建重组质粒pET-30a-Hq001并转化至感受态大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,对目的蛋白进行重组表达。使用开源软件AlphaFold v2对去除信号肽的Hq001氨基酸序列进行三级结构预测,以此得到三维理论模型。并使用开源软件GROMACS v2023对三维理论模型进行分子动力学(MD)模拟优化,应用ANOLEA和MolProbity等工具对模型质量进行评价。结果由Hq001构建的重组表达质粒pET30a-Hq001在E.coil BL21中表达后以包涵体形式存在。序列比对与结构建模结果均表明Hq001蛋白具有典型双Kunitz-BPTI型结构域,并与Bikunin、Boophilin、Ornithodorin、Ixolaris等具有抗凝血活性的KunitzBPTI型蛋白具有序列及结构相似性。经过1 ns的分子动力学模拟优化后理论模型均方根偏差在3?左右达到平衡,选取其中能量态最低的结构模型(总能量=-20716640 kJ/mol)作为最终模型。结论蛋白质三维理论模型证实Hq001蛋白具有保守的Kunitz-BPTI型结构域,与来自微小扇头蜱的Boophilin在序列与结构上均较为相似,Hq001蛋白可能具有Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂相似的结构与功能。

青海血蜱唾液腺重组Hq001蛋白表达及纯化条件的优化

目的对青海血蜱唾液腺重组Hq001蛋白的表达条件(表达菌株及诱导条件)及纯化方式(非变性及变性纯化)进行优化。方法将重组质粒pET-30a-Hq001分别转化至不同感受态菌株[E.coil BL21(DE3)、E.coil Rosetta(DE3)、E.coil ArcticExpress(DE3)pRARE2],确定最适表达菌株后,对IPTG终浓度(0、0.5、1.0 mmol/L)、诱导温度(20、25℃)及诱导时间(0、2、4、6、8 h)进行优化。最佳诱导条件表达的菌体经高压均质破碎后,采用非变性(变性-复性-过柱)及变性(变性-过柱-复性)两种方式进行Ni-NTA亲和层析纯化。表达及纯化产物均经12%SDS-PAGE分析。结果重组Hq001蛋白最适表达菌株为感受态E.coil BL21(DE3);最适诱导条件为:IPTG终浓度0.5 mmol/L,诱导温度25℃,诱导时间4 h。非变性纯化方式可获得相对分子质量约为18800的目的蛋白,大小与预期相符。结论采用优化的表达条件及纯化方式可获得青海血蜱唾液腺重组rHq001蛋白。

以髓磷脂相关抑制因子及其受体为靶点的脊髓损伤免疫治疗策略研究

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)往往导致患者下肢活动功能受限,甚至瘫痪,降低患者生活质量,且治愈率低。髓磷脂相关抑制因子(myelin associated inhibitors,MAIs)是抑制受损中枢神经系统(central nervous system,CNS)再生修复的一个重要因素。对MAIs及其信号通路的干扰能有效逆转CNS神经再生抑制信号,促进脊髓损伤后轴突的再生。MAIs抑制轴突再生信号通路的发现及其深入研究为损伤脊髓的免疫治疗提供了充分的理论依据和研究靶点。将对抑制神经再生信号通路中MAIs及其受体的生物学功能新进展以及以此为治疗靶点设计的脊髓损伤免疫治疗策略作一综述。

核酸疫苗的安全性及其优化策略研究

核酸疫苗是20世纪90年代兴起的一种新型疫苗,已在免疫学及预防医学等方面显示出巨大潜能,迄今已有10余种被FDA批准进入非临床和临床试验。然而,目前仍存在许多尚未解决的问题,如生产工艺、质量标准、制剂和效应,特别是安全性方面的问题,它直接关系到核酸疫苗的应用。因此,解决安全问题是目前核酸疫苗研究的热点和焦点。核酸疫苗的安全隐患主要包括基因整合、免疫学疾病、种属、个体差异性及生产带来的一些安全隐患。为此,对其进行优化设计及生产主要应从表达载体、免疫佐剂、免疫途径及免疫程序等方面进行优化。主要就核酸疫苗的安全性方面问题及有关优化策略作一综述,希望对核酸疫苗的基础研究与临床应用具有一定的指导意义。

蜱源Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制分子的结构与功能研究进展

蜱是一类体外吸血寄生虫,在吸血过程中蜱会向宿主体内释放多种抗凝血物质以保证血液的供应。其中含Kunitz结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂在抗凝血作用中占主要地位。不同的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有相似的保守序列,但总体结构不同,在凝血级联中通过抑制丝氨酸蛋白酶类的凝血因子而阻断下游凝血因子的活化,以达到抑制凝血的效果。蜱源Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂在凝血系统中的靶点繁多且抑制机制各异。本文对该类蛋白酶抑制剂的抗凝靶点及作用机制进行归纳,有助于抗凝和抗血栓药物的研发,同时进一步解释蜱与宿主间的相互作用以及蜱源抗凝药物的药理作用,为预防蜱对宿主的侵害提供参考资料。

青海血蜱Hq012基因在大肠埃希菌中的表达与纯化

目的优化青海血蜱重组Hq012蛋白(rHq012)包涵体的诱导表达和纯化条件。方法从青海血蜱cDNA表达文库中克隆到1个在GenBank中无同源序列的新基因Hq012,构建原核表达质粒pET-30a-Hq012并转化大肠埃希菌感受态细胞[Escherichia coli Rosetta(DE3)],用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达rHq012。高压均质机裂解细菌,用6 mol/L盐酸胍溶解包涵体。比较先复性后纯化和先纯化后复性2种方法所得目的蛋白的产量。先复性后纯化即用稀释法复性后再用镍离子亲和层析法纯化蛋白;先纯化后复性即用镍离子亲和层析法纯化后再进行透析法复性。用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。结果Hq012基因的核苷酸序列长度为759 bp,包含1个486 bp的开放阅读框,编码一个相对分子质量为18500的蛋白质。诱导表达以浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导8 h蛋白表达量最高,包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解。与先纯化后复性相比,先复性后纯化收获的rHq012产量相对较高。镍离子亲和层析纯化后的蛋白质相对分子质量约为17000,与预期的结果一致。结论0.1 mmol/L IPTG诱导8 h是青海血蜱rHq012蛋白的最佳诱导条件,先复性后纯化的方法是蜱源重组蛋白rHq012更优的纯化方法,研究为包涵体蛋白的纯化提供了参考。

钝顶螺旋藻藻蓝蛋白β、α亚基基因的克隆及各亚基原核表达载体的构建与表达

目的克隆钝顶螺旋藻藻蓝蛋白(CPC)β、α亚基的基因序列,分别构建β和α亚基的原核表达载体,并在大肠杆菌内表达这2个亚基。方法首先利用PCR技术扩增钝顶螺旋藻藻蓝蛋白基因序列,将扩增产物克隆入pGEM-T easy载体内,测序分析插入片段的正确性。然后以克隆的cpc基因为模板分别扩增藻蓝蛋白的β和α亚基的编码基因cpcB和cpcA,经测序分析正确后将此二基因分别克隆入表达载体pGEX-4T-1,获得重组质粒pGEX-4T-cpcB和pGEX-4T-cpcA。将所构建的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,用IPTG诱导重组蛋白表达。利用蛋白纯化树脂Glutathione Sepharose^(TM)4 Fast Flow纯化目的蛋白,并测定其浓度。结果在本次实验中成功克隆了钝顶螺旋藻的藻蓝蛋白β和α亚基的编码基因cpcB和cpcA,构建了它们的原核表达载体,并在大肠杆菌中分别表达了融合蛋白β-CPC-GST和α-CPC-GST,这2个重组蛋白的分子量分别为45 kDa和44 kDa,其中β-CPC-GST主要为包涵体,α-CPC-GST主要为分泌型表达。结论克隆并在大肠杆菌内成功表达了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的β和α亚基。

青海血蜱重组rHq002蛋白包涵体的纯化

目的对青海血蜱重组r Hq002蛋白包涵体进行复性及纯化。方法将重组质粒pET-30a-Hq002转化E. coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组Hq002蛋白;超声破碎菌体,收集细胞碎片,用PBS缓冲液和低浓度尿素进行多次洗涤;洗涤后的包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解,稀释法进行蛋白复性;用镍离子亲和层析法纯化蛋白后,分别于4和-20℃保存7 d后进行12%SDS-PAGE鉴定。结果经PBS缓冲液和低浓度尿素多次洗涤,可去除大量的水溶性杂质和部分水不溶性杂蛋白,初步纯化了包涵体;包涵体经6 mol/L盐酸胍溶解后可直接稀释复性重组蛋白;经镍离子亲和层析纯化后的蛋白相对分子质量约27 000,与预期相符,4和-20℃保存7 d未出现降解或者聚集。结论成功获得含二硫键的蜱源重组蛋白,本研究的复性纯化方法可为纯化包涵体蛋白提供参考。