外源性sHLA-G体外干预对滋养细胞侵袭功能的研究

目的通过观察外源性sHLA-G体外干预对滋养细胞侵袭功能的变化,确定sHLA-G治疗特发性复发性流产患者的有效性及可行性进行研究。方法取早孕人工流产绒毛滋养细胞进行体外培养,sHLA-G进行干预,分别以生理盐水及5%丙种球蛋白干预为对照,流式细胞仪检测CD146黏附分子浓度,观察sHLA-G对体外培养滋养细胞亲润功能的变化。结果分别以0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL不同浓度干预绒毛外滋养细胞EVCT,CD146阳性率分别为18.6%、27.1%、62.3%;绒毛滋养细胞VCT检测CD146阳性率分别为6.1%、7.6%、39.1%。生理盐水干预的EVCT检测CD146阳性率为9.3%;VCT检测CD146阳性率为13.0%。5%丙种球蛋白分别以3 mg/mL、6 mg/mL不同浓度干预EVCT,检测CD146阳性率分别为56.9%、61.7%;VCT检测CD146阳性率分别为15.8%、30.9%。结论外源性sHLA-G主动免疫治疗特发性复发性流产患者胎盘绒毛滋养细胞具有效性和优越性,可作为丈夫淋巴细胞细胞主动免疫治疗无效及丙种球蛋白特异性抗体效价不高治疗无效时的2线治疗措施。

人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达

将编码人组织激肽释放酶成熟蛋白的基因片段扩增并分别克隆到原核表达载体pET2 8(b)及分泌型表达载体pET2 0 (b)中 ,使其C端融合 6×HisTag序列 .转化不同受体菌 ,IPTG诱导表达后利用SDS PAGE、免疫印记等方法对重组蛋白进行分析 .在 6株基因工程菌株中 ,均表达出分子量约30kD的激肽释放酶融合蛋白 ,其中激肽释放酶在pET2 8载体中的表达水平高于pET2 0载体 .pET2 8和pET2 0载体表达的重组激肽释放酶蛋白分别占菌体总蛋白约 2 6 %和 10 % .Western印迹分析表明 ,目的蛋白可与抗人血清KK单克隆抗体发生特异性反应 .未经纯化的激肽释放酶融合蛋白具有一定的水解苯甲酰精胺酸乙酯 (BAEE)的能力 .在大肠杆菌中获得了人组织激肽释放酶的高效表达 ,表达产物具有免疫原性和生物活力 。

sHLA-G对复发性流产患者滋养细胞侵袭功能的影响

【目的】探讨外源性可溶性人类白细胞相关抗原G(sHLA-G)对不明原因复发性流产(RSA)患者滋养细胞侵袭功能的影响,为探索RSA的有效治疗措施提供依据.【方法】正常组30例,为正常早孕人流患者,无自然流产史,孕周8-10周;RSA组20例,相应孕周RSA患者,绒毛组织20例。滋养细胞原代培养,分离绒毛外滋养细胞,正常组患者每例滋养细胞接种1瓶、RSA患者每例3瓶备实验用。正常组及RSA对照组、研究1组、研究2组分别以生理盐水、生理盐水、5×10-4/L%终浓度sHLA-G、0.1%终浓度sHLA-G干预培养16 h,取悬浮细胞获得绒毛外滋养层细胞(EVCT)团,加入CD146单克隆抗体,采用流式细胞仪检测各组滋养细胞CD146阳性率。【结果】①正常组EVCT CD146阳性率为(63.29±6.76)%,明显高于RSA对照组(10.61±3.34)%,P<0.01。②研究1组EVCT的CD146的阳性率为(30.61±7.52)%,较RSA对照组显著升高,P<0.01;研究2组EVCT的CD146的阳性率为(64.15±9.54)%,显著高于研究1组及RSA对照组,P均<0.01,与正常组比较差异无统计学意义,P>0.05。【结论】外源性sHLA-G干预可显著提高RSA患者EVCT侵袭功能,可望成为RSA的有效治疗措施之一。

应用iTRAQ定量蛋白质组学方法筛选乳腺癌患者血清差异表达蛋白

目的筛选乳腺癌患者血清特异性表达蛋白,以寻找乳腺癌早期诊断的生物标志物。方法采集血清,提取蛋白,i TRAQ标记和ESI-QTOF-QⅡ质谱检测,再搜库和Scaffold软件分析,得到各组间血清差异表达蛋白。进一步采用Western blot验证差异蛋白。结果血清中共鉴定出335个蛋白,达到严格定量标准的蛋白151个;乳腺癌与对照组间共筛选出23个差异表达蛋白;乳腺癌与乳腺纤维瘤组间筛选出8个差异蛋白。Western blot验证Serotransferrin,Vitronectin,soform 1 of Gelsolin 3个蛋白在各组中的表达结果与i TRAQ检测结果一致。结论本研究证实i TRAQ-LC-MS/MS技术能够快速、有效地进行差异蛋白质组学研究,并筛选到多个与乳腺癌发病相关的血清蛋白,有可能作为乳腺癌早期诊断的生物标志。

人胰激肽释放酶基因的克隆及表达载体的构建

目的 :克隆中国人胰组织激肽释放酶基因 ,构建原核、真核表达载体 ,为开发生产人源激肽释放酶基因工程产品及人源激肽释放酶基因药物奠定基础。方法 :提取人胰腺组织总RNA ,逆转录后琼脂糖电泳初步鉴定PCR产物。将激肽释放酶cDNA回收、补平后插入克隆质粒KS ,酶切鉴定后 ,对激肽释放酶基因进行序列测定分析。用双酶切法 ,插入原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。酶切鉴定后 ,进行序列测定分析。结果 :本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比 ,碱基序列相同。测序分析表明人胰组织激肽释放酶基因经酶切 ,正确插入到原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。结论 :克隆并构建成功中国人组织激肽释放酶基因的原核、真核表达载体 。

利用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达人胰激肽释放酶

目的 建立表达人胰激肽释放酶杆状病毒 /昆虫细胞表达系统 ,制备人胰激肽释放酶。方法 将中国人胰脏组织激肽释放酶基因克隆至pBacPAK9载体上 ,测序分析后 ,和BacPAK6病毒DNA共转染Sf2 1细胞 ,在细胞内同源重组。筛选出重组的杆状病毒 ,鉴定表达的重组人胰激肽释放酶。结果 经电位滴定法检查 ,其感染的Sf2 1细胞上清具有激肽释放酶活性。结论 重组病毒在昆虫细胞Sf2 1中表达了中国人胰激肽释放酶 。

胃癌患者长链非编码RNA的差异表达

目的研究胃癌患者癌组织长链非编码RNA(lncRNA)的差异表达。方法提取8例胃癌患者癌组织与癌旁对照样本中的总RNA,应用lncRNA表达谱芯片检测技术对两者之间差异表达的lncRNA进行分析。在差异表达倍数≥10的lncRNA中选择4个lncRNA(uc010lhn、uc.341、AK096257及BC048127),利用荧光定量RT-PCR技术在细胞水平对微阵列检测结果进行验证。结果胃癌患者癌组织与癌旁对照样本间差异表达的lncRNA共2 621个,其中1 215个表达上调,1 406个表达下调,差异表达倍数≥10的lncRNA 22个。荧光定量RTPCR验证结果显示,与正常胃上皮细胞系GES-1相比,4种lncRNA(uc010lhn、uc.341、AK096257及BC048127)在胃癌细胞系中的表达具有显著差异,与芯片检测结果一致。结论多种lncRNA在胃癌患者肿瘤组织中呈异常表达,其中uc010lhn及uc.341等在胃癌发生、发展过程中可能起一定的作用。

深圳地区儿童铅暴露情况分析

目的 研究深圳地区儿童头发、血清中铅的含量。方法 采用石墨炉原子吸收光谱法测定 975例小于 13岁不同年龄组儿童发铅、血铅含量 ,对儿童铅暴露情况进行分析。结果 60 5例儿童头发中 ,2 0 7%超出发铅标准值10 73 μg/g,3 70例儿童血铅中 ,92 4%超出血铅值 0 10 μg/ml,5 7 3 %超出血铅值 0 70 μg/ml,13 0 %超出血铅值 3 0μg/ml,属于重度超标。结论 深圳城市环境对儿童的铅污染程度不可忽视。

人胰岛素样生长因子在pET-DsbA载体中的克隆及表达

目的通过重组技术,对胰岛素样生长因子IGF-Ⅰ基因进行缺失、突变以获得最有利于高水平表达的IGF-ⅠcDNA。构建原核表达载体,并进行表达,以获得能够高水平表达高活性产物的基因工程菌珠。方法提取人肝脏组织总RNA,RT-PCR后琼脂糖电泳初步鉴定产物。将cDNA回收、补平后插入克隆质粒KS,酶切鉴定后,对IGF-Ⅰ基因进行序列分析。采用PCR法从克隆质粒中扩增IGF-Ⅰ片段,亚克隆至pET-DsbA原核表达载体,酶切鉴定,并进行序列测定。转化到大肠杆菌BL21(DE3)PLysS中,IPTG诱导表达,聚丙稀酰胺凝胶电泳、WesternBlot分析目的蛋白。结果成功构建原核表达载体pET-DsbA-IGF-Ⅰ,测序结果与预期序列完全一致,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达出IGF-Ⅰ融合蛋白。结论IGF-Ⅰ融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)PLysS中的表达,对进一步研究IGF-Ⅰ的功能及开发其生物制品具有重要意义。

肺表面活性物质羊膜腔注射预防早产儿呼吸窘迫综合征的疗效及药物浓度分析

目的:探讨肺表面活性物质(PS)羊膜腔注射预防早产儿呼吸窘迫综合征(NRDS)的药代动力学机制及疗效。方法:(1)药代动力学研究。实验动物为妊娠25天的兔胎。将0.1ml PS注入羊膜腔内,分别于1h、2h、4h(Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组)娩出兔胎并处死;气管内给药PS 0.1ml或生理盐水0.1ml(Ⅳ组、对照组)后1h,娩出兔胎并处死。各组留取兔胎末端肺组织检测DPPC浓度。(2)临床研究:妊娠28～32周胎肺不成熟早产病例。随机分为3组:PS羊膜腔给药组,分娩前将固尔苏1支注入羊膜腔内;PS气管内给药组,新生儿娩出后立即将固尔苏1支经气管插管注入支气管内;对照组,出生前后不予PS预防性给药。结果:(1)药代动力学:Ⅰ组与Ⅳ组比较,兔胎肺组织中DPPC含量无明显差异[(1.133±0.402)mg/g肺组织vs(1.170±0.145)mg/g肺组织,P>0.05],两组均明显高于对照组[(0.684±0.158)mg/g肺组织,P均<0.01]。Ⅱ组、Ⅲ组兔胎肺组织中DPPC含量较Ⅰ组明显下降,与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。(2)临床研究:3组新生儿孕龄、出生体重无明显差异。PS羊膜腔给药组及PS气管内给药组新生儿NRDS发生率无明显差异(13.3%vs 14.3%,P>0.05),显著低于对照组(35%)(P均<0.05);两组持续正压通气的频率无明显差异(16.6%vs 22.8%,P>0.05),均显著低于对照组(57.5%)(P均<0.05)。新生儿住院时间PS羊膜腔给药组为(27.8±9.6)天,PS气管内给药组为(26.8±11.7)天,均显著短于对照组[(33.7±11.8)天](P均<0.05)。PS羊膜腔给药组及气管内给药组新生儿均存活,对照组死亡4例。结论:PS羊膜腔给药可显著降低早产儿NRDS发生率并改善预后,可取得和气管内给药一样的效果,临床应用风险小,操作简单,值得临床推广应用。

人组织激肽释放酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人组织激肽释放酶基 (h -TKK)基因真核表达质粒。方法 设计含pnI和BamHⅠ酶切位点的人组织激肽释放酶基因引物 ,采用PCR法从原核pBluescripeⅡKSKK ( +)中扩增KKcDNA片段 ,亚克隆至pAd track -CMV真核表达载体 ,转化感受态大肠杆菌DH10B ,酶切鉴定阳性重组子 ,并进行序列测定。结果 经PCR能扩增出 73 8bp的片段 ,与预期片段大小相符 ,构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段 ,测序结果与预期序列完全一致。结论 成功构建了人组织激肽释放酶基因真核表达重组体pAdtrack -CMVKK。

人组织激肽释放酶成熟蛋白的纯化及活性分析

目的 制备纯化人组织激肽释放酶 ,并检测其生物活性 ,为中试放大及纯化工艺奠定基础。方法 使用麦芽糖 (MBP)融合分泌载体pMBP P ,构建并筛选出 1株工程菌株 ,在 6L培养基中经IPIG诱导表达人组织激肽释放酶融合蛋白。目的蛋白经亲和层析纯化及凝血酶切割后 ,采用电位滴度法测定其活力。结果 筛选出的工程菌株表达相对分子质量约 70 0 0 0的激肽释放酶融合蛋白 ,大小与预计大小相符。纯化后共获得 2 8mg蛋白 ,并具有水解苯甲酰精胺酸乙酯 (BAEE)的能力。结论 成功进行了人组织激肽释放酶融合成熟蛋白的小量制备 ,经纯化后的产物具有生物活性 ,为中试放大、纯化工艺研究奠定了基础。

人胰激肽原酶的表达

目的 克隆人胰腺组织激肽原酶基因 ,构建分泌型原核表达载体。方法 使用RT PCR的方法扩增人胰腺组织cDNA ,从中扩增出激肽原酶基因。将扩增的激肽原酶基因用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后 ,连接到同样双酶切处理的pET 2 0b(+)载体上 ,酶切鉴定后 ,进行核苷酸序列分析和融合蛋白的表达。结果 将IPTG诱导表达的菌体进行SDS PAGE ,在相对分子质量 31 .4× 1 0 3处可见明显的高表达带。蛋白质免疫印迹实验表明 ,重组蛋白具有激肽原酶的抗原性。结论 成功克隆人胰腺组织激肽原酶基因 ,并高效表达融合蛋白 。

人组织激肽释放酶基因的克隆及融合蛋白的表达

目的 开发激肽释放酶基因工程产品,为开展基因治疗高血压奠定基础。方法 采用RT-PCR的方法合成人胰腺 cDNA,从中扩增出Kallikrein(KK)基因。经 XhoI和EcoR I双酶切后,连接到pET-28b(+)载体上,酶切鉴定后,进行核苷酸序列分析和融合蛋白的表达。结果 将IPTG诱导表达的菌体进行SDS-PAGE电泳,与蛋白标准品比较,在相对分子质量31800处可见明显的高表达带。免疫印迹实验表明重组蛋白具有KK的抗原性。结论 已成功克隆并表达了人胰腺组织激肽释放酶基因,为进一步开发基因工程产品及进行基因治疗高血压研究打下了基础。

Construction and Identification of Human Tissue Kallikrein Gene Eukaryotic Expressing Vector

To clone and sequence the human tissue kallikrein gene of Chinese, and to construct eukaryotic expression recombinant of KK, total RNA was extracted from human pancreas and human tissue kallikrein gene cDNA was amplified by PCR after reverse-transcription by using Oligo（dT） primer. The original kallikrein cDNA was recovered and filled with Klenow enzyme and inserted into KS plasmid. After restriction endonuclease digestion, KK cDNA was sequenced by ABI 377 analyzer. Then the KK gene was amplified from pBluescript KSKK and inserted into pcDNA3. A sequence comparison showed that the cloned kallikrein gene was only one nucleotide different from that reported in the Genbank. The coding amino acid was Asp in the Genbank gene, while the coding amino acid of Chinese kallikrein gene was Asn. The KK cDNA fragment was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3. The cloned kallikrein gene and the pcDNA3KK can be used for further study in gene therapy.

血镉对儿童外周血TH_1、TH_2细胞亚群的影响研究

目的:研究血镉对儿童外周血TH1、TH2细胞数水平的影响。方法:采用原子吸收法测定血镉的含量,流式细胞分析方法测定TH1、TH2细胞水平。结果:血镉异常组TH1、TH2细胞水平与血镉正常组相比有显著差异(P<0.05)。结论:血镉含量增高会降低儿童外周血TH1、TH2细胞数水平。

抑郁模型大鼠海马内特异性microRNAs的筛选以及柴胡疏肝散的干预作用

目的:筛选慢性应激抑郁模型大鼠海马内特异性表达的microRNAs,同时观察中药柴胡疏肝散对海马内microRNAs表达的影响。方法:将SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、柴胡疏肝散组。采用慢性轻度不可预见性应激配合孤养复制抑郁模型,运用敞箱试验和蔗糖水消耗实验观察大鼠行为改变;采用microRNA芯片检测海马内microRNAs的表达。结果:与对照组比较,在模型组海马内差异达2倍以上的特异性miRNA共计有13个,其中下调的miRNA包括miR-298,miR-130b,miR-135a,miR-323,miR-503,miR-15b,miR-532,miR-125a,上调的miRNA包括miR-7a,miR-212,miR-124,miR-139,miR-182;在这13个特异性miRNA中有2个(即miR-125a和miR-182)在柴胡疏肝散组中予柴胡疏肝散干预后又恢复正常。结论:该研究初步发现与抑郁症发病相关的海马内13个特异性microRNAs,其中miR-125a和miR-182在中药柴胡疏肝散干预后恢复正常,这2个microRNAs可能是中药柴胡疏肝散抗抑郁的作用靶点,应进一步分析其靶基因以及作用机制。

深圳地区乙型肝炎病毒DNA基因分型与临床的关系

目的 检测血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA并进行基因分型。方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV DNA后,用不同的探针,利用微板杂交法将其分为6个亚型。结果 150例HBV DNA阳性病人中,B型50例、C型36例、D型13例、F型3例和A型1例,没有发现E型。另有47例为混合型,其中以B、D型(18例)、C、D型(20例)为主,分别占混合型的38.30％与42.6％。受检病人中,B型感染者丙氨酸氨基转移酶水平明显增高;B型感染者比C型感染者抗HBe阳性率高,分别为64.0％和30.5％,而C型感染者比B型感染者乙型肝炎e抗原阳性率高,分别为47.2％和21.0％;年龄、性别与基因型关系不明显。结论 深圳地区BBV基因亚型以B型为主,C型次之,其他较少。基因型与肝炎程度有一定关系。

123 I-血管内皮生长因子结合位点在人类肿瘤细胞的表现特征

目的 探索肿瘤血管内皮生长因子（VEGF）受体（VEGFR）在人类肿瘤细胞的表现特征.方法 将123 I-VEGF165和123 I-VEGF121标记于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人类肿瘤细胞株（HMC-1、A431、KU812、U937、HEP-1、HEP-G2、HEP-3B、Raji）、多种人体肿瘤及邻近的非瘤组织和外周血液细胞.统计特异性结合位点最大结合容量（Bmax）值、解离常数（Kd）以及放射性同位素的50％特异性结合所需浓度（IC50）数值.判断各种细胞与123I-VEGF165和123I-VEGF121结合亲和力、数量、特异性.结果 在HUVEC表面发现两种123I-VEGF165结合位点,而123I-VEGF121是单类结合位点.123I-VEGF121位于特定细胞株（HUVEC、HEP-1、HMC-1）和特殊的早期肿瘤（早期黑色素瘤、乳腺导管内癌、卵巢癌和脑膜瘤）中.与外周血液细胞和非瘤组织相比,肿瘤细胞的VEGFR数量明显较多.在123I-VEGF165标记的VEGFR中,早期黑色素瘤、乳腺导管内癌、肝细胞癌、乳头状甲状腺癌、卵巢癌、肾细胞癌的Bmax值分别为45±13、13±3、25 ±8、5±2、42±12、20 ±6.而在123I-VEGF121标志的VEGFR中,早期黑色素瘤、乳腺导管内癌、卵巢癌的Bmax值分别为30 ±8、8±3、20 ±6.123I-VEGF165和123I-VEGF121与诸多人体肿瘤细胞或组织具有特异性结合能力.与123I-VEGF121相比,123I-VEGF165可与更多不同种类的肿瘤细胞相结合,且容量大.结论 123I-VEGF165可能是肿瘤体内成像的一个潜在有效靶点,有望用于肿瘤的诊断与治疗.