RNA干扰作用(RNAi)研究进展

RNA干扰作用 (RNAi)是生物界一种古老而且进化上高度保守的现象 ,是基因转录后沉默作用 (PTGS)的重要机制之一 .RNAi主要通过dsRNA被核酸酶切割成 2 1～ 2 5nt的干扰性小RNA即siRNA ,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现 .RNAi要有多种蛋白因子以及ATP参与 ,而且具有生物催化反应特征 .RNAi是新发现的一种通过dsRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径 。

应用抑制消减杂交和cDNA芯片技术筛选流行性感冒病毒感染相关基因

病毒基因组有限的编码能力和以病毒蛋白为靶的抗病毒药物易出现耐药性 ,使从病毒感染宿主筛选病毒感染相关生物大分子作为抗病毒药靶和诊断标志物成为新的研究方向。为了筛选流行性感冒 (流感 )病毒感染相关基因 ,采用抑制消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术 ,以流感病毒A/鲁防 / 93 - 9(H3N2 )感染的MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库。从文库中随机挑取约 80 0个克隆 ,PCR扩增其中插入片段 ,经纯化、紫外定量后 ,用基因芯片自动点样仪点在氨基片上 ,制备cDNA芯片。将流感病毒感染的MDCK细胞和正常MDCK细胞的总RNA分别用Cy3、Cy5反转录荧光标记后 ,与cDNA芯片杂交 ,用芯片扫描仪扫描获得芯片杂交信号 ,经阳性对照校正和归一化处理后 ,以如下条件作为判定基因差异表达的标准 ;(a)Cy3与Cy5的信号比值大于 1 5 (正常细胞用Cy5标记 )或小于 0 6 7(正常细胞用Cy3标记 ) ;(b)Cy3和Cy5信号值之一必须大于 10 0 0。经cDNA芯片筛选获得了 18个流感病毒感染特异性克隆 ,经测序和生物信息学分析发现均为流感病毒感染相关新基因EST。流感病毒感染相关基因cDNA片段的获得 ,为新型病毒药靶诊断标志物发现和功能研究提供了基础。

pH敏脂质体对反义寡核苷酸抗流感病毒活性的影响

为了研究具有临床应用前景的 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 脂质体转运系统，以临床药用大豆磷脂为主要原料制备了ｐ Ｈ 敏脂质体，并测定了脂质体体外转染活性、ｐ Ｈ 敏特性、细胞毒性和对 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 抗流感病毒活性的影响 结果发现，批号为 ９８０５１９０３，９８０５１１０２ 和 ９８０５１２０２ 的脂质体具有较高转染活性，但只有ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ 转染活性的 １／５０～１／１００当质粒／脂质体（ Ｗ ／ Ｗ ）为 １∶４～１∶８，转染时间为 ３～５ ｈ，质粒量为 ０５ μｇ，转染后 ２４～４８ ｈ 内检测时转染活性最高 脂质体 ９８０５１２０２ 表现明显 ｐ Ｈ值依赖溶解红细胞膜特性，而脂质体 ９８０５１１０２ 和 ９８０５１９０３ 的 ｐ Ｈ 敏特性不明显 脂质体细胞毒性明显降低，如 ９８０５１９０３、９８０５１１０２ 和 ９８０５１２０２ 的毒性分别是 ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ 毒性的 １／１６、１／８ 和 １／４ｐ Ｈ 敏脂质体 ９８０５１２０２ 具有促进 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 抗流感病毒作用，当 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 浓度为 ０２ μｍ ｏｌ／ Ｌ 时，ｐ Ｈ 敏脂质体 ９８０５１２０２ 使其抗病毒活性提高 ５ 倍，但 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 浓度较高时ｐ Ｈ 敏脂质体对 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ抗?

硫代反义寡核苷酸在细胞培养内抗甲型流感病毒活性

为了研究抗流感病毒特异性反义核酸药物，针对Ａ型流感病毒基因组３′和５′端保守序列，设计并合成了４条硫代寡核苷酸（ＯＤＮ）：３′端反义ＯＤＮ（ＩＶ３＃）与３′端正义ＯＤＮ（ＩＶ３Ｓ），５′端反义ＯＤＮ（ＩＶ４＃）与５′端正义ＯＤＮ（ＩＶ４Ｓ）。以流感病毒血凝滴度和致细胞病变作用为指标，测定了ＯＤＮｓ在ＭＤＣＫ细胞中对Ａ型流感病毒Ａ／京防／８６－１（Ｈ１Ｎ１）复制的影响。结果表明，与流感病毒基因组５′端互补的ＯＤＮＩＶ４＃为１μｍｏｌ／Ｌ时，对病毒复制抑制率近５０％，为１０μｍｏｌ／Ｌ或更高时，抑制率超过７０％，ＩＶ４＃抑制病毒活性呈序列和剂量依赖性。为了提高ＩＶ４＃的细胞摄取效率，对其进行脂肪链修饰，并在ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染条件下考察了对病毒的抑制作用。结果发现，脂肪链修饰的ＩＶ４＃抑制病毒活性无明显增高；ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ能显著提高ＩＶ４＃及其脂肪链修饰物抑制病毒活性。

分子信标核酸检测技术研究进展

介绍了分子信标设计和分子信标核酸检测原理、技术特性和在基因突变大规模自动化检测中的应用．分子信标是一种基于荧光共振能量转移现象设计的发卡型寡核苷酸探针，空间结构上呈茎环结构，环序列是与靶核酸互补的探针，茎序列由与靶序列无关的互补序列构成，茎的一端连上荧光分子，另一端连上淬灭分子．通过空间结构改变决定分子信标发射荧光特性，从而对核酸进行定量检测．分子信标技术具有操作简单、敏感、特异、可对核酸进行液相实时检测和对活体内核酸动态进行检测等特点，已应用于ＨＩＶ辅助受体基因等基因突变的大规模自动化检测，是一种新型核酸定量检测技术．

反义寡核苷酸体外抗流感病毒活性

为了获得具有抗流感病毒活性的反义寡核苷酸 ,针对A型流感病毒基因组 3′和 5′端保守序列 ,设计并合成了多条硫代寡核苷酸 (ODN) :3′端反义ODN(IV3#)与 3′端正义ODN(IV3S) ;5′端反义ODN(IV4#)与 5′端正义ODN(IV4S)以及由 5′和 3′端正义 /反义保守序列组成的复合序列ODN(IV6#和IV7#)。测定了PS ODN的体外细胞毒性和在MDCK细胞中对流感病毒复制的影响。结果表明 :( 1 )PS ODN浓度高达 50 μmol/L时对MDCK细胞末表现有毒性作用 ;( 2 )与流感病毒基因组 5′端互补的ODNIV4#以及由 5′和 3′端保守序列构成的IV6#ODN和IV7#ODN均具有较高的抗病毒活性 ;如IV4#ODN浓度为 1 μmol/L时对流感病毒A/京防 /86 1 (H1 N1 )抑制率近 50 % ,浓度为 1 0 μmol/L或更高时抑制率超过70 % ,且IV4#抑制病毒活性呈现明显的序列和剂量依赖性 ;( 3)IV4#ODN不仅对A型流感病毒H1 N1 亚型有抑制作用 ,对H3N2 亚型也表现较高的抑制活性 ;( 4 )病毒感染复数 (MOI)对IV4#ODN抗病毒活性有一定影响 ,当MOI较低时 ,IV4#ODN表现的剂量效应关系更加明显。抗流感病毒反义寡核苷核IV4#ODN的发现为进一步研究流感新型药物奠定了实验基础。

便携式接触网几何参数激光测量仪的研制

针对电气化铁路检修工区接触网日常巡检的需求,研制了一种便携式激光测量仪,用于接触网几何参数的日常检测。结合接触网几何参数的测量方法建立了有效的测量模型;基于DSP2812为主控芯片,完成了激光传感器、角度测量传感器、摄像头等硬件电路设计,并完成了激光测量仪的软件设计。通过实验,验证了测量仪设计的正确性。

化学修饰对反义寡核苷酸稳定性及抗流感病毒活性的影响

为了探讨 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 化学修饰形式与 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 稳定性，体外细胞毒性以及抗流感病毒活性之间的关系，合成了 ７ 种不同化学修饰形式的 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ：硫代 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 及其 ３′端分别磷酸化和胆固醇修饰；３′与 ５′端硫代，中间为天然结构的混合骨架 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ；天然结构 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 及其 ３′端分别磷酸化和胆固醇修饰等．测定了 ７ 种修饰体在小鼠血清， Ｍ Ｄ Ｃ Ｋ 细胞裂解液，含 ２％ 胎牛血清的 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ培养液以及水中的稳定性，体外细胞毒性和在细胞水平抗流感病毒活性．结果表明，混合骨架 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ，硫代 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 及其 ３′端接磷酸和胆固醇的修饰形式在小鼠血清， Ｍ Ｄ Ｃ Ｋ 细胞裂解液与含２％ 胎牛血清的 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培养液中稳定性相对较高，作用 ２４～４８ ｈ 仅混合骨架 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 与硫代 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 发生部分降解；天然结构 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 及其 ３′端接磷酸和胆固醇修饰体在 ２４ ｈ 内大部分降解．所有 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 修饰体在水中具有很高稳定性，４８ ｈ 内未见降解作用．７ 种 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 修饰形式在 Ｍ Ｄ Ｃ Ｋ 细胞中未表现明显的细胞毒性．硫代 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 及其

抗肿瘤反义寡核苷酸药物研究现状和趋势

以基因为靶的反义药物是抗肿瘤新药研究和开发的重要方向之一 ,已有近 10种不同抗肿瘤反义寡核苷酸药物正在进行Ⅱ或Ⅲ期临床试验。基于肿瘤相关基因的多样性和复杂性 ,抗肿瘤反义药物的发展趋势是研究和开发靶向特定基因治疗特定类型肿瘤的“窄谱”抗肿瘤反义药物 ,以及由靶向多个肿瘤相关基因的反义寡核苷酸组成的“复方”式“广谱”抗肿瘤反义药物。

我国三峡库区移民家庭收入的微观影响因素

利用重庆市云阳县移民的调查数据,按移民类型和受教育程度对移民家庭收入进行统计分析。然后,按移民类型、受教育程度、年龄段进行分组,对影响移民家庭收入的微观因素进行回归估计。结果显示:移民家庭的经营土地对其家庭收入的贡献不大;劳动力对家庭收入的贡献最大;从年龄结构的角度看,31～45岁、46～60岁年龄段的劳动力对家庭收入的贡献最大;当劳动力的人均受教育年限达到大专水平时,家庭收入会随着劳动力文化水平的提高而增加;16～30岁年龄组中大专文化劳动力比例对家庭收入的贡献显著为正;31～45岁、46～60岁年龄组中初中文化劳动力比例对家庭收入的贡献显著为负;劳动力的非农业收入明显高于农业收入。最后提出:应鼓励移民从事非农业;鼓励青年和中年劳动力向工业和服务业发达的城市自愿流动;鼓励移民子女接受大专及以上教育;尽快健全城镇和农村移民的养老保险制度和最低生活保障制度。

流感泰得在小鼠模型中抗流感病毒活性研究

为了在动物整体水平评价流感泰得 (flutide ,FT)抗流感病毒活性 ,建立了流感病毒感染小鼠实验模型 ,并测定了FT在小鼠模型中的抗病毒活性和对小鼠的急性毒性作用。结果表明 ,流感病毒A 京防 86 1(H1N1)和A 沪防 93 9(H3N2 )在小鼠体内连续传代 6次时即对小鼠具有感染性 ,表现为小鼠体重下降 ,小鼠肺脏湿重增加并能检测到很高的病毒滴度。在小鼠模型中FT具有较高的抗病毒活性 ,表现在FT能明显提高病毒感染小鼠的存活率 ,抑制病毒感染引起的小鼠体重下降和肺湿重增加。当FT剂量为 6.5× 10 -4μmol g和 32 .5× 10 -4μmol g滴鼻给药时 ,小鼠存活率分别提高30 %和 5 0 % (P <0 .0 5 ) ;给药途径对FT抗病毒作用有一定影响 ,静脉注射高于腹腔注射和滴鼻给药 ;当接种剂量为 5 2× 10 -4μmol g时 ,FT对小鼠的生长状态、体重和肺脏湿重等均无影响。以上结果为抗流感病毒反义寡核苷酸药物研究向临床前试验过渡提供了试验依据。

基于以太网的103通信规约在微机馈线保护装置中的研究与实现

IEC60870-5-103通信规约是电力系统通信常用的通信规约,许多继电保护设备的通信模块都是基于这个规约设计制造的,但详细的通信流程却大不相同。首先在分析研究了微机馈线保护装置硬件结构的基础上,重点论述了基于以太网的103规约的实现方案,然后提出了一种有限状态机的软件设计方法,并利用Linux环境下的Socket编程,实现了基于以太网的103通信规约的软件编程。

HBV耐药相关DNA突变体的构建及在寡核苷酸基因芯片分析中的应用

拉米呋啶(Lamivudine)是近年来开发成功的一种治疗HBV慢性感染病人的核苷类药物。随着拉米呋啶在临床上广泛使用,HBV耐药现象已成为临床实践中的棘手问题。建立HBV耐药测定技术成为HBV基础研究和临床实践中企待解决的一个重要问题。寡核苷酸芯片(Oligochip)是近年来发展并逐步成熟的一种高通量基因检测技术,已成功应用于基因突变快速和高通量检测。本研究在构建HBV拉米呋啶抗性相关HBV多聚酶基因突变体基础上,设计并制备了HBV耐药寡核苷酸芯片(HBV-LamOligochip)。根据HBV拉米呋啶抗药性相关突变主要位于HBV多聚酶基因的L526、A546、M550和V553等氨基酸位点,设计了28条寡核苷酸探针。探针对应序列为HBVDNA聚合酶基因反义链,HBVHBVhb长度为15-18nt。探针合成时在其3'端接氨基和间隔臂(spacer)等特定修饰;探针纯化与定量后,用基因芯片点样仪点到醛基修饰载玻片上,制成HBV耐药寡核苷酸芯片(HBV-LamOligochip)。为了分析基因芯片的性能,克隆了833号HBV病人血清中HBVDNA聚合酶基因,测序证实为HBVDNA野生型(即未发生突变)。以该DNA为模板,用PCR法构建了HBV耐药相关突变体。用HBV-LamOligochip对HBV野生型DNA和人工构建DNA突变体进行了检测。结果发现,HBV-LamOligochip能有效检测出野生型DNA序列。

丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)研究进展

由于缺乏合适的HCV感染细胞模型 ,严重制约了HCV复制 ,特别是HCV复制的关键因子依赖于RNA的RNA聚合酶 (RdRp)的研究 .对HCV序列比较分析并通过异源表达证明NS5B是HCV复制的RdRp .NS5BC端疏水性氨基酸区域以及NS5B与细胞膜形成复合体等影响NS5B溶解性 .在合适的反应条件下NS5B可以多种RNA分子为模板催化RNA复制 ,特别是能有效复制HCV全长 (+ )RNA .高浓度GTP激活HCVRdRp活性 .NS5BN/C端缺失突变和保守性A、B、C区中的点突变影响RdRp活性 ,但D区 345位精氨酸突变为赖氨酸时RdRp活性明显升高 .

丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶基因克隆与原核表达

丙型肝炎病毒 (HCV)依赖于RNA的RNA聚合酶 (RdRp)是参与病毒基因组RNA复制的一个关键蛋白因子 ,是研究抗HCV新型药物的重要靶标 ,获得纯化的RdRp产物是建立靶向RdRp药物高通量筛选体系和抗病毒药物研究的关键步骤。以HCV病毒基因组全长cDNA质粒 (p90 HCVFL longpU)为模板 ,设计了特异性扩增RdRp的引物 ,通过CPR扩增获得编码RdRp的基因。将该基因克隆到T载体中 ,构建了重组质粒 ,通过克隆快速筛选和酶切分析筛选到含RdRp基因的阳性克隆(克隆号为 4 4 ) ,DNA序列分析证实 4 4号阳性克隆RdRp基因序列与cDNA质粒中的相应序列完全一致。将含RdRp基因的重组质粒 (44号 )用NheⅠ XhoⅠ双酶切 ,获得RdRp基因 ,将该基因连接到用NheⅠ XhoⅠ双酶切的原核表达载体pET2 8(a)中 ,构建了重组质粒pET2 8(a) NS5B ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经 1mmol LIPTG诱导 ,SDS PAGE分析 ,发现一条特异性蛋白带 ,相对分子质量约 6 6× 10 3 ,与预期的完全一致。HCVRdRp基因的克隆与表达为靶向RdRp的新型抗HCV药物研究 。

电力电子技术在风力发电中的应用

随着经济的快速增长和社会的全面进步,我国的能源供应和环境污染问题越来越突出。开发和利用可再生能源的需求更加迫切。风能作为可再生能源中最重要的组成部分和唯一经济的发电方式,由于其清洁无污染、施工周期短、投资灵活、占地少,具有良好的社会效应和经济效益,已受到世界各国政府的高度重视。随着现代电力电子技术以及变频调速技术的迅速发展,其在风力发电中的应用也更为广泛。重点介绍了电力电子技术在风力发电中的主要应用,包括风力发电系统的分类;双馈风力发电双向变频器的优缺点;风力发电的输送方式等。最后对风力发电的前景进行了展望。

cDNA芯片阳性对照的制备及在芯片敏感性分析中的应用

cDNA芯片是一种高通量基因表达谱分析技术,在生理病理条件下细胞基因表达谱分析,新基因发现和功能研究等方面具有广阔应用前景。cDNA芯片阳性对照的选取以及cDNA芯片检测敏感性是芯片成功应用的关键问题之一。以在系统发育上与人类基因同源性小的荧火虫荧光素酶基因为材料,制备了用于人类和其他动物基因表达谱cDNA芯片的通用型阳性对照探针和相应的mRNA参照物,经反转录对mRNA参照物进行Cy3荧光标记并与DNA芯片杂交后发现,mRNA参照物能特异性地与荧光素酶基因cDNA片断杂交,而与人β-肌动蛋白基因、人G3PDH基因以及λDNA/HindIII无杂交反应。把mRNA参照物以不同比例加入HepG2总RNA中,经反转录荧光标记后与cDNA芯片杂交,结果发现,当总RNA中的mRNA含量为1/104稀释(即mRNA分子个数约为108个)时,cDNA芯片基本检测不出mRNA标记产物的杂交信号。而且,cDNA芯片检测的信号强度与芯片上固定的探针浓度密切相关,当探针浓度为2g/L时,杂交信号最强,随着探针浓度下降芯片的杂交信号趋于减弱。cDNA芯片通用型阳性参照物的制备以及应用于cDNA芯片检测敏感性研究为cDNA芯片应用于人和其他动物基因表达谱高通量分析和新基因功能研究提供了技术基础和理论依据。

重购轻租还是租售并重:居住方式对农民工举家迁移影响的实证研究

基于中国居民收入调查(CHIP)2002、2007、2008和中国劳动力动态调查(CLDS)2014的农民工数据,采用统计描述和Probit回归分析考察了农民工的居住方式对举家迁移决策的影响及其动态变化过程。实证结果表明:自购房和独立租赁住房的农民工最有可能实现举家迁移,居住在工厂宿舍和建筑工地的农民工难以实现举家迁移;大专及以上文化程度的农民工最有可能实现举家迁移;在工业部门就业的农民工难以实现举家迁移;家中有老人需要赡养的农民工难以实现举家迁移。考虑到城市房价的飙涨,农民工实现举家迁移成为城市市民的主要路径在于吸纳农民工安居的城市公租房制度。