基于LCK募集和活化的嵌合抗原受体T细胞的结构优化及其功能研究

目的 通过对二代嵌合抗原受体(CAR)进行淋巴细胞特异蛋白酪氨酸激酶(LCK)结构改造,探讨能否增强二代CD137 CAR-T细胞的活化水平及杀伤肿瘤细胞效率,为制备新型二代CAR-T细胞奠定基础。方法 利用基因工程技术,构建靶向人表皮生长因子受体-2(HER2)的CD137-LCK2 CAR和CD137-PYAP2 CAR的慢病毒载体,经慢病毒包装、感染活化T细胞后制备出CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞。采用流式细胞术、酶联免疫吸附实验、细胞毒性实验分别检测新构建的CAR-T细胞在活化分子CD137的表达水平、表型分布、分泌的细胞因子水平及对表达HER2的肿瘤细胞的杀伤效率。结果相较于二代CD137 CAR-T细胞,经过结构改造的靶向HER2的CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞能够上调活化分子CD137的表达、增加细胞因子IFN-γ的分泌、增强对靶细胞的杀伤能力,且均有统计学差异;同时能够维持在记忆状态、受抗原刺激后可迅速活化增殖分化。结论 靶向HER2的CD137-LCK2和CD137-PYAP2 CAR-T细胞有望比二代CD137 CAR-T细胞能更有效活化并发挥抗肿瘤效应。

谷氨酰胺缺乏诱导CD8^(+)T细胞铁死亡促进肿瘤生长

目的探究谷氨酰胺(glutamine,Gln)对CD8^(+)T细胞抗肿瘤免疫反应的影响及机制。方法TCGA数据库分析肿瘤Gln代谢与浸润CD8^(+)T细胞数量及功能的关系。利用CRISPR/Cas9敲低MC38细胞GLS表达,构建小鼠肿瘤模型。流式细胞术检测肿瘤增殖和凋亡,分析肿瘤浸润免疫细胞数量和功能。用Gln缺乏的培养基、完全培养基或添加GSH、RSL3的培养基分别处理CD8^(+)T细胞,检测GSH含量,细胞凋亡,GPX4和Lipid-ROS及效应功能蛋白表达,并进行RNA-seq分析。结果肿瘤Gln代谢与肿瘤浸润CD8^(+)T细胞数量和功能负相关。敲低MC38细胞GLS表达抑制了C57BL/6肿瘤的生长及Ki67的表达,促进了Caspase3表达,提高了肿瘤浸润免疫细胞的数量,抑制了肿瘤浸润CD8^(+)T细胞PD-1、TIM-3和LAG-3表达,并提高了CD8^(+)T细胞CD137、CD107a、IFN-γ及TNF-α表达。RNA-seq结果显示,Gln缺乏后CD8^(+)T细胞铁死亡相关基因TFRC、HMOX1、CYBB、SLC7A11表达上调。Gln缺乏后CD8^(+)T细胞死亡增多、CD137、CD107a、IFN-γ、GSH和GPX4表达下调,Lipid-ROS表达上调;补充GSH后CD8^(+)T细胞GPX4上调,Lipid-ROS下调,CD8^(+)T细胞分泌的IFN-γ增多。结论Gln缺乏诱导CD8^(+)T细胞铁死亡抑制其效应功能。

探析中小户型住宅的室内空间复合设计

本文从中小户型住宅的室内空间设计角度出发,阐述了空间复合的内涵,并运用功能叠加、空间整合的设计方法对中小户型住宅空间进行优化,提出了可变式设计和开放式空间等强化空间适应性的复合设计理念,希望能够充分挖掘空间潜质,最大化地利用空间资源,使之成为健康、舒适、集约、高效的多功能住宅产品。

浅析小户型住宅室内精细化设计的内涵及方法

本文剖析了小户型住宅室内精细化设计的内涵,提出了小户型住宅室内精细化设计的方法,以期对小户型住宅的居住质量和舒适程度的提高有所帮助,希望对建筑设计师、室内设计师及居住者的小户型住宅室内精细化设计有所裨益。

地铁隧道清洁市场需求及发展前景分析

地铁隧道清洁市场是在经济社会迅速发展、城市化进程加快导致城市轨道交通里程数和客运量都飞速增长的基础上形成和发展的。随着地铁隧道清洁负担的进一步加重,市场对于地铁隧道清洁设备提出了新的发展要求。文章分析了地铁隧道清洁市场发展的历史和现状,从而对如今地铁隧道清洁市场的发展前景进行了判断,并通过对现有清洁设备的介绍分析得出如今的行业痛点以及未来产业化的发展方向。

探析“灰空间”的存在形式及其室内空间设计

本文从室内空间设计的角度出发,剖析了"灰空间"的界面限定和存在形式,总结出室内"灰空间"的设计原则,提出"灰空间"对于空间规划、平面布局和生活品质的重要意义,希望能够丰富室内空间设计理论的研究。

昆明市城区立交桥附属空间的调查现状及策略

对昆明市城区立交桥附属空间进行了实地调查,分析了昆明市城区主要立交桥附属空间的利用现状和存在问题,并从空间利用效率、城市生态功能等方面,提出了相应的解决策略,有利于城区立交桥附属空间的合理规划与科学发展。

β2微球蛋白-接头蛋白2-人类白细胞抗原A24(β2m-linker 2-HLA A24)蛋白的生物信息学分析、真核表达与鉴定

目的应用生物信息学方法对β2微球蛋白-接头蛋白2-人类白细胞抗原A24(β2m-linker 2-HLA A24)蛋白进行结构、功能预测分析,并对该蛋白进行真核表达与纯化。方法运用在线蛋白质分析软件ProtParam预测β2m-linker 2-HLA A24蛋白理化性质;磷酸化位点预测软件NetPhos和蛋白质二级结构预测软件SOPMA分析其磷酸化位点和二级结构;并利用蛋白质结构模型预测工具SWISS-MODEL建立三级结构模型。构建含组氨酸标签(His tag)的重组质粒pcDNA3.4/β2m-linker 2-HLA A24-His tag,在Expi293F细胞表达,经镍柱亲和层析获得β2m-linker 2-HLA A24蛋白;采用SDS-PAGE、Western blot、间接ELISA验证蛋白的纯度和性质。结果β2m-linker 2-HLA A24蛋白含有44个磷酸化位点,属于亲水性蛋白,二级结构以无规卷曲为主,并成功构建三级结构模型;成功构建pcDNA3.4/β2m-linker 2-HLA A24-His tag重组质粒,并在Expi293F细胞表达系统中获得可溶性表达。结论成功构建β2m-linker 2-HLA A24蛋白,生物信息学结果显示该蛋白具备与抗原肽结合并激活T细胞的功能。为后续联合使用该蛋白与抗原肽激活抗原特异性CD8^+T细胞实验奠定了基础。

丙氨酸氨基转移酶水平对原发性肝癌发病风险的预测价值(附95780例报告)

目的探讨丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平对原发性肝癌(以下简称肝癌)发病风险的预测价值。方法采用回顾性队列研究方法。收集2006年7月至2007年12月在华北理工大学附属开滦总医院(26980例)、开滦林西医院(18306例)、开滦赵各庄医院(14469例)、开滦唐家庄医院(4389例)、开滦范各庄医院(4561例)、开滦荆各庄医院(7623例)、开滦吕家坨医院(4249例)、开滦林南仓医院(3136例)、开滦钱家营医院(6356例)、开滦马家沟医院(2319例)、开滦医院分院(3392例)行健康体检的95780例受试者的体检资料,其中男76491例,女19289例;年龄为(51±11)岁,年龄范围为18~98岁。依据ALT三分位水平将受试者分为3组:T1组31859例(ALT<14.7 U/L),T2组30627例(14.7 U/L≤ALT<22.0 U/L),T3组33294例(ALT≥22.0 U/L)。由固定医师团队于2006、2008、2010、2012、2014年在相同地点按相同健康体检顺序对受试者进行体检,收集流行病学调查内容、人体测量学及实验室检查指标。观察指标:(1)3组受试者的临床特征比较。(2)受试者随访和肝癌的发病情况。(3)影响受试者新发肝癌的危险因素分析。(4)ALT对肝癌模型预测价值的比较。采用健康体检的方式进行随访,随访内容为肝癌新发病情况和患者生存情况。以2006年首次健康体检时间作为随访起始时间,随访终止事件为发生肝癌、失访、死亡。随访时间截至2018年12月31日。正态分布的计量资料以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析。偏态分布的计量资料以M(范围)表示,多组间比较采用Kruskal⁃Wallis秩和检验。计数资料以绝对数和(或)百分比表示,组间比较采用χ^2检验。采用Kaplan⁃Meier法计算累积发病率,累积发病率的组间比较采用Log⁃rank进行检验。使用限制性立方样条曲线(RCS)计算连续变化的ALT和肝癌发病风险的剂量反应关系。而后采用COX比例风险模型分析不同ALT水平分组影响肝癌发病的风险比(HR)和95%可信区间。使用似然比检验和赤池信息量准则(AIC)计算ALT对于肝癌预测模型拟合情况的影响。使用C⁃统计量计算不同模型的预测能力。结果(1)3组受试者的临床特征比较:T1组受试者男性、年龄、收缩压、舒张压、腰围、体质量指数、总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性、高血压病、糖尿病、肝硬化、脂肪肝、恶性肿瘤家族史、吸烟、饮酒、体育锻炼分别为23516例、(53±14)岁、(130±21)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、(82±12)mmHg、(85±10)cm、(24±3)kg/m 2、(4.9±1.1)mmol/L、1.11mmol/L(0.79~1.63 mmol/L)、(5.4±1.6)mmol/L、(1.5±0.4)mmol/L、(2.3±1.0)mmol/L、478例、12758例、2482例、15例、5899例、1071例、9553例、5434例、5210例;T2组受试者上述指标分别为24886例、(52±12)岁、(132±21)mmHg、(84±12)mmHg、(87±10)cm、(25±3)kg/m 2、(4.9±1.2)mmol/L、1.27 mmol/L(0.91~1.90 mmol/L)、(5.5±1.7)mmol/L、(1.6±0.4)mmol/L、(2.4±0.9)mmol/L、744例、13884例、2677例、13例、9365例、981例、8935例、5216例、5023例;T3组受试者上述指标分别为28089例、(50±12)岁、(132±21)mmHg、(85±12)mmHg、(89±10)cm、(26±3)kg/m 2、(5.0±1.2)mmol/L、1.45 mmol/L(1.02~2.28 mmol/L)、(5.6±1.8)mmol/L、(1.6±0.4)mmol/L、(2.3±0.9)mmol/L、1416例、15471例、3583例、70例、15277例、1350例、10514例、6184例、4447例;3组受试者上述指标比较,差异均有统计学意义(χ^2=1181.88,F=350.52、148.39、417.75、948.63、1917.20、111.60,χ^2=3747.25,F=133.78、18.17、14.45,χ^2=478.33、306.60、181.38、58.19、5649.18、38.82、45.69、35.11、152.64,P<0.05)。(2)受试者随访和肝癌的发病情况:95780例受试者随访时间为9.05年(8.75~9.22年),共有新发肝癌351例,肝癌总发病密度为3.39/10000人年,女性肝癌发病率为1.11/10000人年,男性肝癌发病率为3.97/10000人年。T1组、T2组、T3组肝癌的发病密度分别为2.09/10000人年、2.54/10000人年和5.42/10000人年。T1组、T2组、T3组受试者的肝癌累积发病率分别为2.47‰、3.10‰和6.11‰,3组比较,差异有统计学意义(χ^2=63.50,P<0.05)。(3)影响受试者新发肝癌的危险因素分析。COX比例风险模型分析结果显示:校正性别、年龄、体质量指数、总胆固醇、空腹血糖、HBsAg阳性、高血压病、糖尿病、肝硬化、脂肪肝、恶性肿瘤家族史、吸烟、饮酒、体育锻炼后,与T1组比较,T3组新发肝癌的风险增加(HR=1.87,95%可信区间为1.40~2.49,P<0.05)。RCS结果显示:ALT与肝癌的发病风险呈非线性相关,且曲线呈上升趋势(RCS_S1_χ^2=7.21,P<0.05)。(4)ALT对肝癌模型预测价值的比较:建立多因素模型,将性别、年龄、体质量指数、总胆固醇、空腹血糖、HBsAg阳性、高血压病、糖尿病、肝硬化、脂肪肝、恶性肿瘤家族史、吸烟、饮酒、体育锻炼因素共同带入模型中,计算此模型的C统计量、-2Log L值和AIC值,分别为0.791、6313.30和6345.30。将ALT三分位数分组带入模型中,以T1组为对照组计算此时模型的C统计量、-2Log L值和AIC值,分别为0.792、6300.48和6328.48。多因素+Fbg模型的C统计量和AIC数值降低,与多因素模型的-2Log L值的差值为12.82,差异有统计学意义(χ^2=12.82,P<0.05)。结论ALT是肝癌的独立危险因素。在建立肝癌预测模型或评估肝癌发病风险时,ALT可作为重要的参考指标。

音乐教学中培养学生创新思维初探

曾有位教育学家做过这样的实验,他在黑板上用粉笔画了一个圆点,问在座的高中生:"这是什么?"得到异口同声的回答:"是粉笔点!"这位教育学家来到幼儿园,对着孩子们做了同样的实验,可得到的答案竟有几十种之多!

日本卡乐比如何打造国民零食品牌?

根据日本流通经济研究所所发布的销售点管理系统数据（POS），2016年11月28日至12月4日的一周里，销量最好的零食前20位中卡乐比占了3位。在强项薯条类别里，更有三分之二的商品来自卡乐比。它是怎么做到的？