变性双链法实现葡萄糖异构酶基因敲除的研究

对７号淀粉酶菌Ｍ１０３３的遗传背景进行分析，建立了其原生质体制备、转化的优化条件。构建了葡萄糖异构酶（ＧＩ）结构基因内插入硫链丝菌肽基因（ｔｓｒ）的置换型同源重组质粒，利用其变性双链片段实现与Ｍ１０３３菌株染色体上基因的同源重组，获得置换型葡萄糖异构酶缺陷型菌株Ｍ１０３３ＬＪ。为在染色体上引入突变位点实现染色体上分子定点改造奠定了基础。

链霉菌M1033同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株的构建

为实现有工业生产价值的葡萄糖异构酶双突变体酶GI(G1 38P G2 47D)的稳定高效表达 ,在建立 7号淀粉酶链霉菌M1 0 33原生质体转化条件的基础上 ,构建了含 6 0 0bp不完整GI(G1 38P G2 47D)结构基因片段的插入型同源重组质粒pXW ,并通过同源重组模式整合到M1 0 33的染色体上 ,实现了GI基因的破坏 (genedisruption) ,获得了同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株 .对同源重组片段的分析 ,突变引入的验证以及缺陷型菌株稳定性的检测证实了以此方法在染色体上引入突变的可行性 .