重组毕赤酵母菌高密度表达人源抗-HBs Fab抗体的研究

目的 探讨抗 HBsFab抗体发酵工程菌GS1 1 5 /Fab的高密度发酵及对发酵产物的纯化与活性鉴定方法。方法 采用补料分批培养方法 ,在 5L发酵罐中对发酵工程菌GS1 1 5 /Fab进行高密度发酵 ,发酵温度 2 8～ 30℃ ,pH值范围为 5 0～ 5 5 ,溶氧范围 2 0 %以上 ;3次发酵分别于OD60 0 值达到 4 0 0～4 5 0、2 0 0～ 2 5 0、30 0～35 0时开始诱导 ,甲醇诱导浓度为 0 5 %～1 % ,经 96h左右的诱导后终止发酵 ,对发酵上清进行亲和纯化 ,并通过ELISA法对纯化产物进行活性鉴定。结果 在OD60 0 为 30 0～ 35 0时开始诱导有利于发酵过程条件的控制和目的蛋白的表达 ,目的蛋白表达量为 2 4 5mg/L。发酵上清通过亲和层析纯化 ,获得纯度为 98%的重组Fab抗体 ,该抗体经ELISA分析具有较高的HBsAg抗原亲和力及特异性。结论 Fab酵母菌工程菌在 5L发酵罐高密度发酵成功 ,为抗

抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2融合蛋白的构建与序列测定

目的:构建以人抗乙肝表面抗原（HBsAg）单链抗体（ScFv）为导向作用,白细胞介素-2（IL-2）为治疗作用的融合蛋白原核表达载体pQE 40/ScFv-IL-2。方法:应用PCR技术将抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2在分子水平上进行基因重组,构建中间载体pGEM7Zf（+）/ScFv-IL-2,经酶切鉴定及序列测定正确后,将目的基因片段克隆到pQE 40表达载体中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约4.3×104Da处,可见蛋白表达带。以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的融合蛋白。结论:融合蛋白ScFv-IL-2的成功构建及表达,为融合蛋白的纯化和研究开发新型的乙肝导向治疗的基因工程药物打下良好的基础。

人源性抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定

目的 :制备有活性的人源性抗HBsAg单链抗体。方法 :应用噬菌体表面呈现技术获得人抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗体的Fab片段 ,并将VH 和VL 基因以 (Gly4Ser) 3linker连接成单链 ,插入表达载体pQE40 ,筛选大肠杆菌高表达菌株。结果 :工程菌表达优化试验表明 ,在OD6 0 0 为 0 6时开始诱导 ,持续 6h ,目的蛋白表达量最高可达菌体总蛋白的 31%。包涵体变性后上样镍离子螯合层析柱一步纯化 ,收集目的峰 ,透析复性 ,得纯度为 97%的重组单链抗体 ,其亲和常数为 0 2 3× 10 8mol L。结论 :抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌内获得高效表达 ,经变性和复性 ,得到有活性的单链抗体 ,氨基酸组成正确。为进行临床前研究打下基础。

重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究表达重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺。方法首先采用摇瓶培养,对培养基配方、pH值、诱导表达时机和诱导剂量进行优化,确定基本发酵参数,然后在30L发酵罐上进行中试规模发酵培养。结果在摇瓶培养时,发现含有甘油和微量元素等成分的改良培养基效果明显优于LB培养基和2×YT培养基,另外,工程茵的最佳pH值为7.0,最佳诱导时机为对数中期,最佳诱导剂浓度为0.4mmoL/L异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖,最佳诱导时间为4h,将摇瓶培养确定的关键参数应用到30L发酵罐中,控制溶氧大于30%,进行3批发酵试验,发现发酵产物的湿菌产量可达58-61.9g/L,目的蛋白质表达量可达28.9%-31.2%以上。结论建立了工程菌M15[pQE-scFv]的中试发酵工艺,为进一步开发打下良好基础。

人源性抗HBs可变区单链抗体基因的构建及核酸序列测定

将通过噬菌体显示技术获得的一株人源性抗HBsFab抗体基因重链和k轻链的可变区用编码柔性肽段的Linker使其连接成单链 ,克隆入中间载体 ,并进行核酸序列测定 ,为其后的表达及双功能抗体的构建打下基础。

亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体

目的 :纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAgFab抗体 ,建立稳定、适于生产应用的纯化工艺。方法 :以原核表达的重组人源性抗HBsscFv免疫BALB/c小鼠 ,经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株 14F7。将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水 ,经辛酸沉淀纯化后 ,制备亲和层析柱 ,纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAgFab抗体。结果 :用抗scFvmAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAgFab的纯度可达 95 %以上 ,回收率可达 70 %～ 85 %。结论 :人源性抗HBsscFv制备mAb作为亲和层析的介质 ,可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAgFab,适用于大规模生产重组人源性抗HBsAgFab。

重组人源性抗HBsAg Fab抗体的特性分析

通过噬菌体展示技术从含高滴度抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体的人外周血淋巴细胞获得抗HBsAgFab抗体的轻、重链基因.将Fab的轻、重链基因分别整合到巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株的染色体上,成功构建了高效分泌表达抗HBsAgFab抗体的酵母工程菌.对酵母表达的重组Fab抗体进行了纯化,并对其相对分子质量、糖基化以及抗原结合能力等特性进行了分析,结果显示重组酵母分泌表达的重组人源性抗HBsAgFab是一个相对分子质量为50000左右的低糖基化糖蛋白.1mg重组Fab抗体相当于40U的抗乙肝表面抗原抗体(20U/mg).表明重组Fab抗体具有较强的结合HBsAg的能力.

重组人抗HBs-Fab抗体的纯化及结构分析

目的研究重组人抗HBs-Fab抗体的纯化工艺,并对其结构等特性进行分析。方法采用离子交换-分子筛层析法分离纯化由酵母工程菌(GS115/Fab)发酵的重组人抗HBsAg Fab抗体,并经ELISA检测其抗体活性,等电聚焦电泳法检测其等电点(pI),基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测其相对分子质量和肽质量图谱。结果纯化的重组Fab抗体的纯度可达90%以上,经Sephacryl-100进一步层析后,纯度达99%以上,总收率可达80%以上。Fab抗体具有较好的抗体活性,其pI值为7·6,为一碱性蛋白,相对分子质量为50494,比其理论值约多2579·35,经Endoglycosidase H内切酶消化后的相对分子质量为49609,证明Fab的一级结构中有糖基化现象,且分布于Fab抗体的H链和L链上。胰酶酶解肽段中有21个与理论肽段相符,另检测到1对二硫键正确。结论已建立了重组人抗HBs-Fab抗体的稳定的纯化工艺,且Fab抗体的一级结构正确。

人源性抗HBsAg Fab抗体的发酵生产研究

为了适应工业生产的需要 ,利用fed batch方法 ,重组人源性抗HBsAgFab抗体酵母工程菌在 30L发酵罐中进行了高密度发酵 ,发酵最适温度 30℃ ,pH值范围 5 0～ 5 3,溶氧范围 2 0 %～ 30 %。发酵液OD6 0 0 值达到 30 0时开始诱导 ,甲醇最佳诱导浓度为 1 0mL L。重组人源性抗HBsAgFab抗体经离子交换层析纯化 ,纯化产品经SDS PAGE、Westernblot进行分析和ELISA方法进行活性测定。结果显示 ,重组Fab抗体在Fed batch发酵系统中可高效表达 ,经过 1 92h的发酵生产 ,重组人源性抗HBsAgFab抗体的表达量可达 4 1 2mg L。发酵上清经过离子交换层析纯化 ,获得纯度为 95 %的重组Fab抗体 ,该Fab抗体经ELISA分析具有较高的HBsAg抗原亲和力和特异性。结果证实可以通过高密度发酵毕赤酵母工程菌来高效生产重组人源性抗HBsAgFab抗体 ,为后续的工业化生产应用奠定了基础。

重组人源性抗HBsAg Fab抗体纯化方法的比较研究

抗HBsAgFab抗体被认为在预防和治疗HBV引起的肝病中具有重要的作用。为了建立稳定的、适于生产应用的重组人源性抗HBsAgFab抗体的纯化工艺 ,本实验对不同纯化方法进行了比较研究。比较了抗Fab抗体亲和层析、ScFv单克隆抗体亲和层析和离子交换层析等 3套纯化工艺在酵母发酵生产的重组人源性抗HBsAgFab抗体纯化中的效率。结果显示 ,抗Fab抗体亲和层析柱纯化酵母表达的重组Fab ,纯度为 96 8% ,但回收率偏低 ,只有30 %～ 4 0 %。ScFv单克隆抗体亲和层析纯化的重组Fab ,纯度为 97 5 % ,回收率达 75 %～ 85 %。该工艺能很好的适应较小规模的生产应用。离子交换层析纯化的重组Fab ,纯度为 97% ,回收率为 75 %～ 85 %。该工艺能很好的适应较大规模的生产应用。以上结果表明 ,应用ScFv单克隆抗体亲和层析和离子交换层析纯化技术均能很好的纯化出重组人源性抗HBsAgFab抗体 ,这两种纯化工艺不仅大大节约纯化成本 ,且纯化效率和回收率有很大提高。

胸腺肽对HBV转基因小鼠表达HBV DNA的影响

应用胸腺肽对ＨＢＶ转基因小鼠进行腹腔内注射（３ｍｇ／只），连续３个月，同时设促肝细胞生长素及生理盐水对照组，定期取血检测ＨＢＶＤＮＡ。结果，发现胸腺肽组ＨＢＶＤＮＡ阴转率为２２％～５５％，停药２２ｄ后阴转率为２２％，而对照组小鼠ＨＢＶＤＮＡ无阴转。结果提示胸腺肽对ＨＢＶ转基因小鼠表达ＨＢＶＤＮＡ有抑制作用。

重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化方法比较研究

目的研究重组人抗HBsAgFab抗体的纯化条件。方法采用羊抗人Fab抗体亲和层析柱、14F7单克隆抗体亲和层析柱、离子交换分子筛层析柱,分别纯化由酵母工程菌(GS115/Fab)发酵的重组人抗HBsAgFab抗体,并对3种纯化方法所得Fab抗体的纯度、收率、与HBsAg的结合活性进行比较。结果3种纯化方法中,14F7单克隆抗体柱纯化的Fab抗体的纯度达98%左右,Fab抗体柱纯化的Fab抗体的纯度为95%,但这两种亲和柱的目的蛋白收率都不高,分别为35%、55%。而离子交换柱纯化的Fab抗体的纯度为93.8%,经分子筛柱进一步纯化后,可达98%以上,Fab抗体蛋白收率可达80%以上。经ELISA分析,3种方法纯化的Fab抗体均具有较高的HBsAg抗原结合力和特异性。结论通过对3种纯化方法的比较得出,离子交换分子筛层析法是重组人抗HBsAgFab抗体的最佳纯化方法,这为抗HBsAgFab抗体的产业化生产和临床研究打下良好基础。

高复制HBV转基因小鼠模型对抗病毒药物拉米夫定评价的研究

[目的]探讨乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠模型筛选抗HBV药物的可行性。[方法]用公认抗HBV复制药物拉米夫定对我们建立高复制HBV转基因鼠进行实验,选我们建立的1.3copy高复制HBV转基因小鼠20只,随机分成两组,每组10只。采用灌胃针灌胃法给药。对照组灌喂生理盐水,实验组灌喂拉米夫定,剂量为100mg/kg,每天2次,连续灌21d,每7d采血1次。荧光定量PCR检测血清中HBVDNA。[结果]实验组用拉米夫定前小鼠血清HBVDNA5.50±0.42(拷贝数log10数值),3周后HBVDNA已显著降低(4.63±0.57),4周后,小鼠血清HBVNDA为4.08±0.51,停药1周后,再次检测血清HBVDNA,小鼠血清HBVDNA又恢复正常水平(5.70±0.39)。[结论]我们建立的高复制HBV转基因小鼠模型验证了拉米夫定对HBV复制的抑制程度和持续时间,表明该模型可应用于抗HBV药物的筛选、评价研究。

人源性抗HBsAg噬菌体抗体的筛选及纯化

目的:获得人源性抗HBsAg抗体Fab片段。方法:用预包被HBsAg的ELISA板,从构建的人全套抗体库中筛选出针对HBsAg的噬菌体抗体。并转入大肠杆菌中表达。破裂细胞后,获得可溶性Fab片段。以羊抗人Fab抗体偶联HiTrap柱。

促肝细胞生长素对小鼠移植肿瘤的实验研究

在肝癌移植小鼠模型成功基础上,应用pHFG对荷瘤小鼠、裸小鼠进行治疗与预防,旨在探讨pHGF在动物体内对肿瘤细胞生长行为的影响,探讨pHGF的可能作用机理.将BEL-7402肝癌细胞移植至BALB/C裸小鼠皮下,将SP2/O骨髓瘤细胞移植至同系BALB/C小鼠皮下,将SP2/O骨髓瘤细胞移植至同系BAL/C小鼠皮下.

pHGF诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究

应用BEL-7402肝癌细胞及正常单层肝细胞作靶细胞,探讨pHGF及分离组分对靶细胞的影响.结果显示,pHGF对7402细胞酶代谢活性有明显抑制作用,并呈量效关系.ID50为350μg/ml,这种抑制作用非样品毒性.组分3、4对7402细胞有显著抑制活性,有效活性比pHGF高25～100倍.pHGF对单层肝细胞有酶活性激活作用,其组分1、2、5作用最为显著.表明pHGF组分中存在正向调节单层肝细胞酶活性的物质,也存在抑制7402细胞活性的负调节因子.进一步研究显示,这种抑制方式是诱发7402细胞发生程序性死亡.

重组人心肌营养素对体外培养受损心肌细胞的保护作用

心肌营养素是一种具有心肌保护功能的细胞因子.为鉴定人心肌营养素在体外具有促进受损大鼠心肌细胞存活的生物学活性,构建pQE-huCT-1表达载体,在大肠杆菌中表达重组人心肌营养素(rhCT-1);利用含有还原型及氧化型谷胱甘肽的复性体系,恢复变性蛋白的天然构象;通过MTT法鉴定rhCT-1的促进受损大鼠心肌细胞存活的生物学活性.pQE-huCT-1在M15菌中得到高效表达,但95%的目的蛋白以包涵体形式存在;通过变性、复性及Ni-NTA纯化,得到纯度为90%的可溶性重组蛋白.利用无血清培养基培养新生大鼠心肌细胞,造成缺血损伤;利用低浓度阿霉素损伤大鼠心肌细胞,构建阿霉素损伤模型;通过加入rhCT-1治疗,发现rhCT-1具有明显的促进受损心肌细胞存活的作用;心肌细胞琥珀酸脱氢酶(SDH)活性随rhCT-1浓度的升高而增强,且呈显著的剂量依赖性关系;通过测定预防组和治疗组心肌细胞SDH和乳酸脱氢酶(LDH)活性,发现预防组较治疗组在促进细胞线粒体产生SDH和降低培养液上清LDH活性方面效果更加显著,说明rhCT-1可能是在心肌细胞损伤早期通过抑制细胞凋亡而达到心肌保护作用的.本研究通过复性获得了可溶性rhCT-1,它在体外具有显著的促进受损心肌细胞存活的生物学活性.

抗HBsAg单链抗体的等电点测定和结构模拟

应用实验生物学和计算生物学方法对重组人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)的部分理化性质和空间结构进行分析 .首先应用蛋白质分析软件包Antheprot预测HB scFv等电点 ,然后等电聚焦测定HBscFv等电点 ,在此基础上 ,用神经网络法预测HB scFv二级结构 ,然后用同源建模的方法 ,获得HBscFv三级结构 .结果发现 ,HBscFv等电点理论值为 8.5 1,实验值为 7.3～ 8.1;PHDsec结果表明 ,HBscFv是一种全β蛋白质 ;三级结构建模表明 ,HBscFv的VH 结构域由 9个片层组成 ,VL 结构域由 8个片层组成 ;由于单链抗体的特殊性 ,三级结构建模无法给出VH 与VL 结构域之间进一步折叠后形成的结构 .