油橄榄查尔酮合酶与查尔酮异构酶基因全长的克隆及序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase,Chs)与查尔酮异构酶(chalcone isomerase,Chi)是植物类黄酮合成代谢途径中的两个关键酶。采用同源克隆、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、融合引物嵌套PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)与3’-c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA end,RACE)相结合,分别克隆出油橄榄chs与chi基因全长。序列分析表明,油橄榄chs基因全长DNA(Gen Bank登录号:KF935223.1)和c DNA(Gen Bank登录号:KF935224.1)序列分别为2 085 bp和1 173 bp,该基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)编码390个氨基酸,其氨基酸序列与葡萄和番茄全长Chs氨基酸序列的相似度在90%左右。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白属于Chs蛋白家族。油橄榄chi基因全长DNA(Gen Bank登录号:KF886190)和c DNA(Gen Bank登录号:KF886191)序列分别为1 373 bp和750 bp,其ORF编码249个氨基酸,该氨基酸序列与已报道的其他植物Chi氨基酸序列的相似度最高在65%左右,序列中包含一段由198个氨基酸残基组成的具有分子内裂解酶活性的功能域,符合Chi蛋白家族特征。

油橄榄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用同源克隆、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、融合引物嵌套PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)与3’-c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术相结合,从油橄榄(Olea europaea)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)基因全长,命名为Oe PAL。序列分析表明,Oe PAL的DNA全长2 970 bp(Gen Bank登录号KJ511867),含一个内含子(393~1 220 bp);全长c DNA有2 142 bp(Gen Bank登录号KJ511868),开放阅读框编码713个氨基酸,与其他植物有较高的同源性。利用该基因构建重组质粒p PICZαA-Oe PAL,且在毕赤酵母X33中进行诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)检测显示该重组酶的分子质量在77.5 k D左右,纯化后的酶比活力为196.3 U/mg。酶学性质研究表明:该重组酶的最适反应条件为40℃,p H 8.8;在供试范围内Cu2+与Na+可以提高该酶活性;以L-苯丙氨酸为底物,在最适条件下该酶的Km为4.89×10-4 mol/L。结果表明成功地克隆到Oe PAL,构建了表达载体,并进行了功能验证。