蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与序列分析

目的构建人蛋白激酶CK2α重组质粒,研究CK2结构和功能。方法采用RT-PCR、定向克隆和DNA测序方法进行实验。结果通过RT-PCR从Hep-3B肝癌细胞中获得人蛋白激酶CK2α(ProteinKinase2α)亚基编码区1136bp的cDNA片段,将扩增基因通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中,用PCR和限制性内切酶分析鉴定,表明获得重组质粒pUCm-T-CK2α。通过对CK2α编码区cDNA序列测序证实其与GeneBank中登记号为NM-01895的序列一致。结论成功构建了重组质粒pUCm-T-CK2α,为利用CK2αcDNA作为探针进行深入研究奠定了基础。

MAPK反义寡核苷酸诱导大鼠成纤维细胞凋亡的研究

目的探讨MAPK反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide,ASO)对大鼠肾成纤维细胞凋亡的影响。方法脂质体转染法将MAPK反义寡核苷酸导入NRK-49F细胞中,Western-blotting测定细胞内MAPK蛋白的表达,DAPI染色观察细胞形态,流式细胞术检测细胞凋亡比率。结果MAPKASO降低细胞MAPK蛋白含量;且可促进细胞凋亡,转染细胞出现凋亡特征性改变,凋亡率为35.8%,与其余各组有显著差异(P<0.05)。结论MAPK反义寡核苷酸通过阻断信号转导分子MAPK诱导大鼠成纤维细胞细胞凋亡,为防治肾移植术后间质纤维化提供一定的理论依据。

反向克隆法大鼠anti-ERK2腺病毒载体构建

目的正义基因反向克隆法构建大鼠anti-ERK2腺病毒载体。方法酶切质粒p3XFLAG-CMV7.1-ERK2,得到ERK2cDNA片段,连接到T载体进行测序,经测序正确反向克隆法插入质粒pShuttle中,最后转入AdEasy(tm)XLAdenoviralVectorSystem系统中得到anti-ERK2基因腺病毒载体。结果DraI和NotI双酶切鉴定anti-ERK2基因腺病毒载体,发现插入的基因序列与插入方向均符合预期目标。结论成功构建了大鼠anti-ERK2腺病毒载体,为研究移植排斥中ERK2基因治疗的作用提供了良好工具。

反义ERK2基因对结缔组织生长因子诱导肾小管上皮细胞向间充质转化的调控效应

目的研究细胞外信号调节激酶2(ERK2)信号转导通路对结缔组织生长因子(CTGF)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)向间充质细胞转化的调控效应。方法腺病毒介导的反义ERK2基因(Adanti-ERK2)按感染强度50、100、200转染HK-2细胞,确定最适感染强度。按作用因素的不同将HK-2细胞分为对照组、Ad-LacZ组、CTGF组和Adanti-ERK2组。免疫组织化学检测E-Cadherin和Vi mentin的表达,Western blot法检测E-Cadherin、Vi mentin及ERK2的表达变化;细胞接种Boyden小室1、3、5 d时检测各组HK-2细胞迁移数目的变化。结果①Adanti-ERK2转染HK-2细胞最适感染强度为100。②HK-2细胞在CTGF刺激下E-Cadherin蛋白表达明显减少,Vi mentin表达增加,同时细胞内的ERK2蛋白表达显著增加;而Adanti-ERK2组E-Cadherin和Vi mentin表达变化不明显,ERK2蛋白表达较对照组明显减少。③接种5 d,HK-2细胞在CTGF刺激下细胞运动能力显著高于其他各组,而Adanti-ERK2组与对照组和Ad-LacZ组相比差异无显著性意义。结论以反义ERK2基因治疗可以有效阻断CTGF诱导的肾小管上皮细胞向间充质转化。提示ERK2信号转导通路在该转化中发挥重要作用。

含人p27基因的重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含有人p27基因和EGFP基因的重组腺病毒载体,并观察其表达。方法利用腺病毒载体系统Adeno-X,通过质粒抽提、电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,构建重组腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP;酶切、PCR鉴定重组腺病毒质粒;利用293细胞包装重组腺病毒载体PAd-p27-EGFP,通过荧光倒置显微镜观察EGFP的表达。结果:经酶切和PCR鉴定,成功构建重组腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP,利用脂质体转染人293细胞后,转染腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP可见EGFP表达和细胞致病效应(CPE)。结论:利用腺病毒载体系统Adeno-X成功构建含CMV启动子的Flag-p27和EGFP基因的腺病毒载体,为进一步研究细胞周期调控与慢性移植物失功之间的关系,并为寻找慢性移植物失功的基因治疗的途径奠定基础。

移动互联网语境下纸媒退出的社交媒体用户话语研究

近年来,纸媒休刊/停刊的消息不断传出,讨论纸媒能否存活以及存活多久意义不大。究其根本,纸媒难以为继源于用户的选择。以新浪微博和知乎平台上自2017年1月1日到2017年12月31日社交媒体用户关于"纸媒退出""报纸停刊"的热门微博和热门评论作为样本,结合纸媒经历的移动互联网时代静态语境以及社交媒体中特有的网络文化动态语境进行研究,可以探索传统纸媒"为何"退出的深层次原因以及勾勒出纸媒"如何"退出的路线图。考察用户语言的文本构成与话语实践,能够发现读者话语背后广阔的社会历史空间与意蕴。针对纸媒存在的问题,可以引入广义新闻、积极使用移动互联网、虚拟现实、增强现实等新技术手段。

黔东傩文化的产业化发展研究

＂傩堂戏＂是一种融汇了民俗、宗教、艺术、伦理等多种元素的多元化文化形式,经历了几千年的积淀,中国傩戏表演的功能和意义早已超出了其出现时期;贵州铜仁市各地的傩戏,源于古老的中华傩文化,具有中国傩文化的普遍特征,也极具地域特色;20世纪80年代,在乌江中下游的思南、德江、沿河等地,发现的古老的＂傩堂戏＂。近年来,随着对地域文化、民间文化、民俗文化的挖掘,黔东地区的傩文化得到了前所未有的关注,黔东傩文化的学术研究和商业开发正日益兴起,铜仁傩文化发展获得了一个千载难逢的良机,在贵州大力发展生态旅游和国家＂大乌江—梵净山生态旅游扶贫项目＂的背景下,对铜仁傩文化的开发也被提到了一个前所未有的高度;但是,发展的过程中难免遇到困难,如何把握这对矛盾关系,把铜仁傩文化旅游打造为贵州生态文化旅游的标签是本文研究的出发点。

阻断ERK2信号转导通路对血小板源生长因子-BB诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移和表达转化生长因子-β1的影响

目的观察ERK2信号转导通路在血小板源生长因子（PDGF—BB）诱导血管平滑肌细胞（VSMC）增殖、迁移和表达转化生长因子（TGF）-β1中的作用。方法将原代培养的大鼠VSMC分为4组：（1）对照组；（2）PDGF刺激组；（3）Ad—LacZ组；（4）Adanti—ERK2组。用Western blot检测细胞磷酸化ERK2蛋白水平；噻唑蓝（MTF）比色法测定细胞增殖率；流式细胞仪检测细胞细胞周期；Boyden小室测定细胞的跨膜迁移能力；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞培养液上清中TGF—β1的浓度。结果Adanti-ERK2组和对照组细胞增殖率、S期细胞百分比及跨膜迁移细胞数目明显低于PDGF刺激组和Ad—LacZ组（细胞增殖率：2．75％、0．00％比64．45％、61．88％；S期细胞百分比：14．18％、13．58％比38．14％、32．99％；跨膜迁移细胞数：8．2±3．2、6．3±2．6比24．8±6．1、23．3±5．8，均P〈0．05）；（2）Adanti—ERK2组和对照组细胞培养上清液中TGF-β1含量明显低于PDGF刺激组和Ad—LacZ组（P〈0．05）；而Adanti—ERK2组明显高于对照组（P〈0．05）。结论ERK2信号转导通路参与调控PDGF—BB诱导的VSMC增殖、迁移和基因表达。反义ERK2基因预先转染阻断ERK信号转导能显著抑制PDGF-BB刺激的VSMC增殖、迁移，阻断细胞周期由G1期进入S期，并且部分下调TGF—β1的合成分泌。

移植物转染反义细胞外信号调节激酶-2基因减轻慢性移植物血管病

目的研究转染反义ERK2基因对慢性移植物血管病的抑制作用及其机制。方法构建含有反义ERK2基因和带有LacZ基因的腺病毒载体。以BN大鼠为供者，Lewis大鼠为受者，制作大鼠腹主动脉移植模型。ERK2组接受转染反义ERK2基因的腹主动脉移植，LacZ组接受转染LacZ基因的腹主动脉移植，对照组接受不进行处理的腹主动脉移植。移植后60d，取各组移植血管和血清样本，以2，3二羟基丙醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参照，计算ERK2条带灰度与GAPDH条带灰度的比值（ERK2／GAPDH，即为ERK2的相对表达强度）；测量移植血管内膜厚度（I）和中膜厚度（M），计算I／（I＋M）之百分比；检测移植血管平滑肌细胞（VSMC）的数目和分布；检测血清血小板源性生长因子一BB（PDGF_BB）的浓度。结果对照组、LaeZ组和ERK2组ERK2／GAPDH的比值分别为1．21±0．15、1.02±0.06和0.47±0．09，后者显著低于前二者（P〈0．05）。对照组和LaeZ组移植血管呈典型的移植物血管病表现，两组I／（I＋M）比值分别为84．1％和79．9％；ERK2组移植血管呈移植动脉内膜炎表现，该组1／（I＋M）比值为13．7％，显著低于前两组（P〈0．05）。对照组和LacZ组内膜增厚处散在分布大量VSMC，计数分别为（71．3±9．2）个和（76．4±11．3）个；ERK2组内膜处VSMC计数为（34．8±5．3）个，明显少于前两组（P〈0．05）。对照组和LaeZ组受者血清PDF-BB浓度分别为（1075±70）pg／ml和（1200±25）pg／ml，ERK2组为（626±27）pg／ml，ERK2组明显低于对照组和LacZ组（P〈0．05）。结论转染反义ERK2基因可减轻慢性移植物血管病，并延缓其进展，其机制可能与VSMC增殖和迁移受到抑制以及PDGF-BB表达下调有关。

腺病毒介导的血红素氧合酶-1基因治疗对同种移植物慢性排斥反应损伤的保护作用

目的探讨腺病毒介导的血红素氧合酶-1(AdHO-1)基因治疗对同种移植物慢性排斥反应损伤的保护作用及其机制。方法选用血管移植和肾脏移植两种慢性排斥反应模型,对同种血管移植物和肾脏移植物进行体外 AdHO-1基因转染,分析慢性排斥反应发生时移植物的结构和功能变化、目的基因和蛋白的表达以及免疫系统的相应反应。结果 AdHO-1基因治疗缓解了慢性排斥反应对同种肾脏移植物的损伤,但弱于对血管移植物的保护效应;空载病毒加剧了同种。肾脏移植物的损伤;AdHO-1基因治疗可减少慢性排斥反应发生时移植物内巨噬细胞和 CD4^+细胞的浸润。结论AdHO-1基因治疗可能通过保护移植物、下调免疫反应、诱导免疫偏移等作用减轻同种移植物的慢性排斥反应损伤。

反义细胞外信号调节激酶对移植物血管的保护作用

目的探讨反义细胞外信号调节激酶(ERK1/2)基因治疗对移植物血管的保护作用及可能的保护机制。方法建立BN至Lewis大鼠的腹主动脉移植模型。反义ERK1/2治疗组移植前取供者动脉血管段给予经脂质体包装的反义ERK1/2基因转染;腹主动脉移植术后1个月内受者每日从尾静脉或阴茎背静脉注入经脂质体包装的反义ERK1/2寡核苷酸100μl。对照组移植未经任何处理的血管段,移植后也无特殊处理。移植术后60d取移植段主动脉进行组织病理学观察内膜和胶原纤维变化;免疫组织化学法观察移植段血管ERK1/2基因的表达和CD4+、CD8+T淋巴细胞的浸润情况;ELISA法检测血清中细胞间粘附分子(ICAM-1)的变化。结果移植术后60d,对照组的移植动脉呈慢性移植物血管病表现,血管内膜显著增厚,移植血管中ERK1/2基因高表达,CD4+、CD8+T淋巴细胞大量浸润;反义ERK1/2基因治疗组移植动脉呈血管内膜炎改变,ERK1/2基因表达不明显,内膜有少量CD4+、CD8+T淋巴细胞;对照组ICAM-1表达显著高于反义ERK1/2治疗组(P<0.05)。结论反义ERK1/2基因治疗对移植物血管具有保护作用,可以减缓慢性移植物血管病的发生,这种保护机制可能和减少ICAM-1的表达以及减少移植血管T淋巴细胞的浸润有关。

染料木黄酮对大鼠移植动脉血管平滑肌细胞的影响

目的 研究染料木黄酮（Gen）对大鼠移植动脉血管平滑肌细胞的影响。方法 以BN大鼠为供者，Lewis大鼠为受者，建立腹主动脉移植模型，将受者随机分为3组。实验组（n=8）：受者术后腹腔注射Gen20mg·kg^-1·d^-1×60d；对照1组（n=8）：受者术后腹腔注射溶剂二甲基亚砜0．5ml×60d；对照2组（n=6）：受者术后不给予任何处理。腹主动脉移植后60d取移植血管进行组织学观察，测量血管内膜厚度；免疫组织化学染色检测血管平滑肌细胞的增殖和迁移情况；酶联免疫（ELIA）法检测血清中血管内皮生长因子（VEGF）、γ干扰素（INF-γ）的变化。结果 验组与两个对照组比较，内膜增厚不明显且巨噬细胞浸润减少；血管平滑肌细胞增殖和迁移减少（P均〈0．01）；两个对照组血清中VEGF、INF-γ表达显著高于实验组（P〈0．01）。结论 染料木黄酮在预防和治疗移植动脉硬化的过程中，对移植动脉血管平滑肌细胞的增殖和迁移有抑制作用，其机理可能与影响VEGF等的表达有关。

结缔组织生长因子诱导人肾小管上皮细胞向间充质细胞转化的实验研究

目的探讨结缔组织生长因子（CTGF）对肾小管上皮细胞向间充质细胞转化的影响。方法体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2），按是否用CTGF处理将其分为实验组和对照组。直接免疫荧光法、间接免疫化学检测培养72h后肾小管上皮细胞E—cadherin、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）、细胞外信号调节激酶2（ERK2）的表达；Western blot方法在72h检测E—cadherin、波形蛋白和ERK2的表达；Boyden小室在1、3、5d检测细胞迁移能力的变化。结果（1）实验组上皮细胞表型标志蛋白E-cadherin随着时间的延长而表达递减，波形蛋白表达渐增，ERK2表达上调；（2）在第1天，实验组与对照组细胞迁移能力差异无统计学意义，第3天实验组迁移至滤膜下面细胞多于对照组，第5天实验组细胞迁移数明显高于对照组[（45．0±1．1）：（14．0±1．2），P〈0．05]。结论在体外，人肾小管上皮细胞由CTGF刺激表现出向间充质细胞转化的特性，并且ERK2信号转导通路可能参与了对这一过程的调控效应。

大鼠供肾转染反义ERK2基因减缓肾移植后慢性移植肾肾病的作用及机制

目的研究腺病毒介导的反义ERK2（Adanti-ERK2）基因转染供肾对减缓肾移植后发生慢性移植肾肾病（CAN）的作用及机制。方法建立大鼠间肾移植模型。按供肾移植前处理方式的不同分为对照组、空载病毒组和基因转染组，每组6只。对照组供肾灌注无菌HTK液0．5ml，空载病毒组供肾灌注含5×10^9pfuLacZ基因腺病毒（Ad-LacZ）的HTK液0．5ml，基因转染组供肾灌注含5×10^9pfuAdantbERK2的HTK液0．5m1。肾移植术后24周行移植肾的病理学观察，免疫组织化学法观察肾小管上皮细胞表面标志蛋白E-Cadherin、Vimentin、TβRⅠ的表达以及CD4＋、CD8＋T淋巴细胞和ED-1＋细胞的浸润情况；酶联免疫法检测受者血清中转化生长因子β（TGF-β1）的含量。结果肾移植术后24周，对照组和空载病毒组移植肾呈CAN表现；肾小球硬化，肾小管萎缩明显，伴严重间质纤维化以及明显的CD4＋、CD8＋T淋巴细胞和ED-1＋细胞浸润；病变区肾小管上皮细胞E-Cadherin表达减少，Vimentin、TβRI表达显著增多。基因转染组移植肾间质内仅有少量CD4＋、CD8＋T淋巴细胞和ED-1＋细胞浸润；肾小管上皮细胞E-Cadherin表达正常。对照组和空载病毒组血清中TGF-β。含量明显高于基因转染组。结论AdantkERK2基因转染移植肾可减缓CAN的发生，对移植肾具有保护作用。这种保护机制可能与减少炎症细胞的浸润、下调TGF-β等致纤维化因子的表达以及抑制肾小管上皮细胞向间充质细胞的转化有关。

世界眼 现代脑 中国心

世界眼。现代脑，中国心。这是西南位育中学的校本教材里经常提到的概念。做一个打上民族底色和国际视野的现代人。做一个具有问题意识和勤思乐学的智慧人，不只是写在书上的期望．也是每个西南位育人生活中有意无意追求的理想。

相信孩童的眼眸

如果一弯新月从梧桐枝头冉冉升起…… 大人在做什么？ 他们照例看着报、洗着碗、听着新闻、做着工作。纤细的月牙儿往往无以勾起他们的注意。似乎只有完满的一轮冰魄才值得一观。还残存着些诗意的大人或许会关注这不完满的美丽——这份残缺，也或许会找到一丝，为那不完美而生发的感伤。