猪传染性胸膜肺炎放线杆菌参考株抗血清的制备及野毒株血清型鉴定

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌全部12个血清型的国际参考菌株接种于培养基大量培养。回收菌体、甲醛灭活后，加入蜂胶佐剂制成疫苗。分别免疫健康的试验用白兔。获得针对该菌单一血清型的抗血清。虽然不同血清型间有一定的交叉反应，但对同源菌株的菌体抗原的凝集效价最高。分别可达6～8个log2。用该套血清对2003年从山东省各地分离到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌野毒株11株进行了血清型鉴定。分别为3型（2株）、4型（1株）、5型（4株）和7型（4株）。

鉴别猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的RT-PCR检测方法的建立

根据Genbank上发表的猪瘟病毒(CSFV)全基因组序列,选择猪瘟强毒株和兔化弱毒疫苗株序列存在的差异区域,分别设计合成两条特异性的上游引物,一条只针对强毒毒株,一条只针对兔化弱毒疫苗株;同时选择高保守区域序列,设计合成了一条强毒和兔化弱毒共用的下游引物,成功建立了一种能够区分猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。应用该方法从猪瘟强毒株和兔化弱毒株中扩增出了大小分别为680bp和785bp的特异性片段。该方法对PRRSV、BVDV、PRV、PCV等病毒基因组扩增,结果均为阴性;该方法可以检测出最低为0.5pg的猪瘟病毒RNA,具有高度的特异性和敏感性。本方法的建立为猪瘟的实验室检测和流行病学调查奠定了坚实的基础。

猪伪狂犬病PCR检测方法的建立

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的一种重要传染病，其中该病对猪的危害最大，每年给世界养猪业造成巨大的损失。目前在世界许多国家和地区屡见发病报道。我国近几年来随着规模化和集约化养猪业的快速发展，从国外引进的种猪日渐增多，伪狂犬病也在我国不断的蔓延和扩大，危害越来越严重。

董箐水电站高尾水变幅发电厂房设计

董箐水电站位于贵州省贞丰县与镇宁县交界处,受下游龙滩水电站水库运行方式的影响,董箐水电站发电厂房尾水变幅很大。为充分利用水能资源,获得更大的经济效益,并减少前期工程投资,董箐水电站厂房采取分期建设的设计思路,同时为保证厂房结构的运行安全可靠,设计时进行了深入的研究和计算分析,提出了合理的厂房结构形式和防裂、抗渗混凝土材料。

洪家渡水电站发电厂房设计回顾

洪家渡水电站发电厂房的设计历程是一个不断优化和精心设计的过程,其中经过了发电厂房布置形式从设有上、下游调压井的一洞三机地下厂房优化为取消调压井的三洞三机地面厂房,装机容量从540 MW调整为600 MW,厂房结构形式采用了新结构,通过这些不断的优化设计,节约了工程投资、降低了施工难度、缩短了建设工期,为首台机提前发电提供了重要技术保障。

高尾水作用下厂房混凝土结构的防裂抗渗研究

总结分析已建水电站厂房的渗漏原因,通过混凝土材料性能分析和材料试验,提出适合高尾水作用下防裂、抗渗混凝土设计指标和混凝土材料,研究细化了止水设计和混凝土的浇筑分层分块,有效解决了厂房混凝土结构的防裂、抗渗技术问题,研究成果已在董箐和沙沱水电站厂房成功应用。

沙沱水电站引水发电建筑物优化和动态设计

通过全面分析沙沱水电站压力钢管结构形式、厂房布置及结构形式、进厂交通方式、开关站布置位置,结合开挖揭露的地质条件和现场施工情况,在招标及施工图阶段,设计对引水发电建筑物布置和结构形式进行了一系列的优化和动态设计。经过优化调整,使得引水发电建筑物在布置上更加合理,结构上更加安全可靠,出线设备运行更加稳定,同时降低了施工难度,简化了施工程序,加快了施工进度,节省了工程投资。

地高辛标记探针检测猪胸膜肺炎放线杆菌的研究与应用

利用PCR反应扩增出胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因650 bp的DNA,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的核酸探针。该探针与不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌均能发生特异性杂交,而与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌等细菌的核酸杂交均为阴性。对胸膜肺炎放线杆菌的最低检出限量为10×102 个放线杆菌。对疑似胸膜肺炎放线杆菌感染病变组织检测结果表明,在扁桃体、鼻腔、气管、肺脏均可检测出胸膜肺炎放线杆菌,以扁桃体的检出率最高。为猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断和流行病学调查提供了良好的方法。

猪胸膜肺炎放线杆菌山东分离株的血清型与Apx毒素型研究

从山东省不同地区采集的85份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌(APP)的分离鉴定,采用凝集试验和PCR方法对分离菌株进行血清型和APX毒素型的检测.结果从山东省不同地区分离到20株分属5个血清型的APP,其中,血清7型6株、血清5型5株、血清3型4株、血清4型3株、血清8型2株,血清7型、5型为优势血清型.不同地区分离的APP血清型不同,同一地区也存在不同的血清型.PCR检测结果表明,不同血清型的APP共含有4种溶血毒素(Apx),其中,血清3、4、8型APP含ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ,血清5型含Apx Ⅰ、ApxⅡ和ApxⅣ,血清7型含ApxⅡ和ApxⅣ,20株APP分离株均含有ApxⅡ和ApxⅣ两种毒素,表明野毒株的血清型与毒素基因的种类有一定的相关性.毒素序列分析结果表明,相同毒素型APP,其毒素基因序列的同源性在99.5%～100%之间,与血清型无关.致病性试验结果表明,所含毒素类型不同的APP对小白鼠的致病性不同,其中含Apx Ⅰ和ApxⅡ的血清5型APP毒力最强.该研究为猪传染性胸膜肺炎的免疫预防、亚单位疫苗的研制及基于ApxⅣ的PCR检测奠定了基础.

猪传染性胸膜肺炎病料中PCV-2和PRRSV的PCR检测

应用PCR方法对从山东省不同地区采集的2 5 3份猪传染性胸膜肺炎肺脏和12 5份临床健康猪肺脏进行PCV_2和PRRSV的检测。结果显示,在传染性胸膜肺炎猪肺脏中,171份为PCV_2阳性,阳性率达6 7 5 % ;10 1份样品为PRRSV阳性,阳性率达4 0 % ;其中,6 8份样品同时检出PCV_2和PRRSV ,共感染阳性率达2 6 8%。而临床健康猪肺组织中,2 1份样品PCV_2检测结果为阳性,阳性率为16 8% ;12份样品PRRSV检测结果阳性,阳性率为9 6 % ,PCV_2和PRRSV共感染未检出。统计结果显示,传染性胸膜肺炎发病猪与临床健康猪PCV_2、PRRSV及PCV_2和PRRSV共感染的阳性率差异极显著,传染性胸膜肺炎发病猪的肺脏中PCV_2和PRRSV的检出率明显高于临床健康猪。上述检测结果提示。

非洲猪瘟病毒P54基因原核表达载体的构建与表达

根据GenBank中非洲猪瘟病毒(ASFV)P54基因序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法从ASFV DNA中分别扩增出了P54基因片段和经过改造的跨膜信号肽缺失的P54基因,将其克隆到表达载体pET28b中,构建了重组质粒pET-P54和pET-P54q,测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE,Western-blotting检测。结果显示,经过改造的信号肽缺失的重组菌pET-P54q可表达出分子质量约24.5 ku的重组融合蛋白,表达的蛋白以可溶形式存在于菌体中,经镍柱亲和层析纯化可获得纯度较高的目的蛋白。纯化的蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,证实,表达的蛋白具有较好的反应原性。

口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立同时检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的多重荧光RT-PCR检测方法。方法根据口蹄疫病毒3D蛋白编码基因、水泡性口炎病毒N蛋白编码基因和猪水泡病病毒VP1蛋白编码基因的高保守区设计特异性引物和探针,对3种动物病毒进行多重荧光定量RT-PCR扩增。结果经过扩增,可以同时检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒,而其他参试病原均无扩增信号,显示其良好的特异性。对口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、猪水泡病病毒的最低检测限分别达到101、102、102个质粒拷贝浓度。结论本方法灵敏度高,特异性良好,可实现多种病毒混合感染的同时检测。

尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL^4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL^5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

活体动物中大环内脂类残留检测微生物抑制法的建立

[目的]建立活体动物中大环内酯类残留的检测方法。[方法]采用微生物抑制方法,对藤黄微球菌CMCC 28001的选择性和特异性、样品提取方法、平板制备条件、方法检出限等技术参数进行研究。[结果]建立的方法可用于活体动物中红霉素、泰乐菌素、螺旋霉素、林可霉素、吉他霉素和克林霉素等6种大环内脂类药物的残留检测。当菌悬液添加浓度为10^(-3)倍稀释液(5.5×106CFU/m L)以及培养基PH值为7.5且培养温度为30℃时,可产生直径最大,边缘光滑、完整、清晰的抑菌圈。[结论]该方法具有良好的敏感性和重复性,成本低,操作简便,是色谱分析、免疫分析等其它方法的有益补充。

一种基于CP204L基因的非洲猪瘟病毒Taq Man-MGB实时荧光PCR检测方法的建立

基于非洲猪瘟病毒(ASFV)CP204L基因序列设计1对特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种检测ASFV的TaqMan-MGB实时荧光PCR方法。结果显示,该方法仅对ASFVDNA呈现特异性扩增,不与猪的其他常见病毒发生交叉反应,具有良好的特异性。该方法对标准对照质粒(PCR2.1-CP204L)的线性检测范围为4.2×10~1~4.2×10~9copies/μL,标准曲线方程为Y=-3.452 3X+39.014,相关系数(R^2)为0.998 8,检测下线为4.2个拷贝。对5个不同浓度(4.2×10~3~4.2×10~7copies/μL)的质粒标准品进行4次双份样品的重复检测,Ct值变异系数均小于1.5%,表明该方法具有良好的重现性。用该方法对总计164份的进口猪临床样品和生猪肌肉样品进行ASFV检测,结果均为阴性。该方法的建立为活猪临床样品和生猪肌肉样品中ASFV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

鸭舍中气载内毒素的测定

对五个鸭舍环境中气栽内毒素浓度与气载需氧革兰氏阴性菌浓度进行了测定，并对二者之间的数量关系进行了统计分析，同时对需氧革兰氏阴性菌的成分进行了研究。在测量的鸭舍中革兰氏阴性菌菌群占优势的是肠杆菌，其中大肠杆菌最为常见。气载内毒素与气载需氧革兰氏阴性活菌含量和气载需氧活菌总数在数值上存在弱的正相关，此结果表明不能通过测定气载需氧革兰氏阴性细菌或需氧细菌总数来估计气载内毒素的含量。舍内气载内毒素的含量介于0．19-20．081063EU／m^3之间；气载需氧革兰氏阴性活茼的含量介于1．69～90．3710^3CFU／m^3之间；气载需氧活菌含量介于1．01～55．7210^4CFU／m^3之间。

我国部分地区传染性羊痒病基因型的分布情况调查

引起羊痒病的病原朊蛋白是一种正常的唾液酸糖蛋白(PrPc)在三级结构发生改变后形成的异常蛋白(PrPsc)。该病的发生与绵羊朊蛋白编码基因PRNP遗传多样性密切相关,主要表现在PRNP第136、154和171位密码子组成的PRNP基因型与绵羊对痒病的抗病性的联系。根据已建立的一种利用荧光定量PCR扩增反应对羊痒病抗性基因进行筛选的方法,对我国部分地区的无角多赛特绵羊羊痒病基因分布情况进行调查,从而从品种选育水平上杜绝羊痒病的发生。

基因3型猪戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

对GenBank中基因3型猪戊型肝炎病毒（HEV）代表毒株基因进行序列分析,最终选定ORF3基因的部分序列为目的基因,运用生物信息学软件设计特异性引物和探针,扩增获得目的片段,并构建重组载体p UC-19-ORF3。梯度稀释重组质粒制备标准品,初步建立检测基因3型HEV的实时荧光定量PCR方法。对建立的检测方法进行特异性、敏感性和重复性验证。结果表明,标准品浓度在108～102 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.996。特异性试验结果显示,其它几种常见猪病病原体（猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒）未见典型扩增曲线。敏感性试验证实本方法的最低检测下限为101 copies/μL。重复性试验表明该方法对3个标准品检测结果的批内和批间变异系数低于2%。用该方法抽检59份进境猪肉样品,同时用普通RT-PCR方法对这些样品进行符合性试验,结果均为阴性。本研究所建立的检测方法不仅适用于进境猪肉样品中基因3型HEV的监控检测,而且还可用于基因3型HEV的早期临床诊断及分子流行病学调查。