西藏高原红细胞增多症发病率及其血红蛋白特异性研究

在西藏两个不同海拔高度地区世居和移居人群中进行高原红细胞增多症(HAPC)调查及对其血红蛋白(Hb)特异性进行研究。结果表明:(1)西藏拉萨地区人群中HAPC总发病率为2.39％,那曲-安多地区为12.95％,随海拔升高而发病率增多,汉族的发病率高于藏族,男性高于女性;(2)HAPC患者红细胞中MetHb为10.14％,显著高于高原健康人红细胞中的MetHb含量(6.35％),这可能是HAPC患者血液携带氧功能降低原因之一;(3)HAPC患者红细胞的穆斯堡尔谱除正常oxy-Hb和deoxy-Hb组分外,还发现存在第三组分“c”,这可能是血红蛋白的变性产物,是否与红细胞携带氧有关尚待研究。

西藏拉萨地区居民红细胞谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶含量和活力

谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体细胞(尤其是红细胞)一个重要的对抗氧化剂作用的防御体系,它在细胞内能消除有害的氧化代谢产物,阻断脂质过氧化连锁反应,从而保护细胞膜结构和功能完整。所以GSH和GSH-Px含量和活力变化是机体氧化物牵制的重要指标。有关正常人和某些疾病患者红细胞GSH和GSH-Px的资料国内外均有报道。本实验对西藏拉萨地区(海拔3658m)居民和北京地区居民的红细胞GSH和GSH-Px含量和活力进行比较研究,目的是探索GSH和GSH-Px与高原适应之关系,为防治高原疾病提供根据。

干细胞因子的研究及其应用

人干细胞因子 (hSCF)是新近发现的重要造血细胞因子 ,它是酪氨酸激酶受体c Kit的配体。SCF主要作用于早期造血干细胞、原始造血祖细胞 ,并且诱导这些细胞的存活、增殖和分化。SCF单独使用生物学作用低 ,但它与其它细胞因子具有强的协同作用。在临床Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期研究中 ,SCF和G CSF联合应用 ,与单独使用G CSF比较 ,CD34+ 细胞数增加 2～ 3倍。安进公司采用基因重组技术在大肠杆菌中生产的重组人SCF (r methSCF )商品名为STEMGENTM。SCF临床使用 ,包括体内干细胞扩增治疗 (exvivo)和用于基因治疗的体外培养造血干细胞。SCF与G CSF联合使用刺激扩增外周血干 祖细胞 (PBPC) ,可用于干 祖细胞移植 ,以增加患者所需PBPC的比例 ,减少收集PBPC的次数。本综述主要介绍了人SCF的功能 。

西藏高原居民红细胞和血红蛋白特性的研究

西藏高原是世界上面积最大、海拔最高的高原,又是藏族人民高度集中,世代久居的地区。揭示藏族世代积累形成的适应高原生活能力的奥秘,是高原医学家长期以来追求的目标。

在中国壮族家系中发现的一例-α~T/-α~Q复合β~0β~0珠蛋白基因型

本文报道在我国广西隆林壮族中发现一个罕見的HbQ复合α,β地中海贫血家系。先证者女,18岁,贫血面容,肝脾肿大。化学结构分析确证本Hb变异体为HbQ Thailand[α74(EF3)Asp→His]。血红蛋白组成以及α和β珠蛋白基因分析结果表明,先证者的珠蛋白基因型为-α~Q/-α~T复合β°/β°(IVSI-1G→T/Codon17A→T);先证者父的基因型为-‘α~Q/-复合β~O/β~A(IVSI-1G→T/β~A);先证母的基因型为-α~T/αα复合β~O/β~A(Codon17A→T/β~A)。

干细胞因子的应用研究

干细胞因子的发现和基因克隆 在20世纪中期就发现两种遗传性贫血小鼠模型为W/WV与Sl/Sld,各为W位点的畸变.

腺病毒介导酪氨酸羟化酶基因体外治疗大鼠泌乳素瘤

目的 探讨腺病毒介导酪氨酸羟化酶(TH)基因治疗大鼠垂体泌乳素(PRL)瘤的可能性。方法 应用细菌内同源重组法构建携带大鼠TH基因并含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的复制缺陷型腺病毒载体Ad-GFP-TH和未携带任何外源基因的复制缺陷型空载体腺病毒Ad-GFP,并以大鼠泌乳素瘤细胞株MMQ为靶细胞,探讨腺病毒介导TH基因治疗对MMQ细胞生长和PRL分泌的影响。结果 成功构建重组腺病毒Ad-GFP-TH及Ad-GFP;转染重组腺病毒Ad-GFP-TH后,MMQ细胞的生长和PRL分泌均受到明显的抑制。结论 基因治疗可能成为垂体泌乳素瘤,尤其是侵袭性垂体泌乳素瘤的有效治疗方法之一。

一种新型人源化鲑鱼降钙素突变体的构建与表达

目的 降低鲑鱼降钙素（sCT）对人体的免疫原性。方法 设计并合成人源化鲑鱼降钙素（11 ～ 17）hsCT基因，用基因重组方法构建表达载体，转入大肠杆菌G1724中，经色氨酸诱导表达；用渗透压法处理菌体纯化融合蛋白；以大鼠血清钙浓度降低方法测定hsCT生物活性；用定量Western blot法测定hsCT免疫原性。结果 重组pTrxFus-hsCT质粒在大肠杆菌中获得高效可溶性融合蛋白表达, 表达水平达46%以上, 并得到纯度约90%的融合蛋白,rhsCT保存了鲑鱼降钙素前体活性的一半以上, 免疫原性降低了55%。结论 获得一种新型人源化降钙素（11 ～ 17）hsCT，其保存较高sCT前体的活性，免疫原性明显降低。

人甲状旁腺素(1-34)衍生物在大肠杆菌中表达、纯化及其生物学活性

为研究Gly hPTH(1 34)衍生物的生物学活性 ,用重叠PCR方法合成编码hPTH(1 34)的DNA片段 ,克隆到融合表达载体pGEX 2T的缩短型谷胱甘肽转移酶基因GST6 9△的 3′末端 ,构建正确读码框架的融合基因 .在两个基因间引入蛋白质羟胺切割位点序列 ,转入E .coliJM10 9中 ,IPTG诱导表达 .该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 2 0 %以上 ,主要以包涵体形式存在 ,盐酸羟胺切割表达产物 .分析表明 ,80 %左右的融合蛋白被裂解为GST6 9△和Gly hPTH(1 34) .经分子筛柱层析和反相层析分离纯化获得重组Gly hPTH(1 34)衍生物 ,纯度达 98%以上 ,回收率约为 10mg/升发酵液 ,分子量为 4 177,等电点 (pI)为 8 4 0 ,N端 16个氨基酸 ,除第一个为甘氨酸外 ,其余与天然hPTH(1 34)序列一致 .Western印迹结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物具有hPTH(1 34)的免疫学活性 .体外活性测定结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物能刺激人成骨细胞HOSTE85增殖、增加细胞内胶原合成、ALP活性增高和cAMP生成量增加 ,并呈量效关系 ,提示它具有与化学合成的hPTH(1 34)相同的生物学活性 ,N端多一个Gly对其活性无明显影响 .

造血因子动员后自体外周血干细胞移植对急性放射病猴的治疗作用

目的 观察重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)或rhG CSF +重组人干细胞因子 (rhSCF)动员后外周血干细胞 (PBSC)自身移植对 7 0Gyγ射线照射猴的治疗效果。方法 15只正常成年猕猴分成照射对照、rhG CSF和rhG CSF +rhSCF 3组。rhG CSF 10 μg/(kg·d) (μKD)连续 5天皮下注射 ,rhSCF 2 0 μKD连续 8天皮下注射 ,后 5天与rhG CSF联用。照射对照组注射等体积的生理盐水。照射当天收集PBSC ,7 0Gyγ射线照射后 3～4h做自体PBSC移植 ,观察其造血恢复情况。结果 在移植后恢复期rhG CSF +rhSCF组白细胞数明显高于对照组和rhG CSF组。rhG CSF+rhSCF和rhG CSF组外周血小板数的恢复优于照射对照组 ,骨髓CFU数明显高于对照组。病理组织学检查表明 ,rhG CSF组骨髓腔内造血细胞数量超过照射对照组 ,但比rhG CSF +rhSCF组少。结论 rhG CSF或rhG CSF +rhSCF组动员后自体PBSC移植可明显促进急性放射病猴的造血功能恢复 ,两因子联用组的效果优于单因子组。

鲑鱼降钙素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法从鲑精ＤＮＡ中分离出编码蛙鱼降钙素（ｓＣＴ）基因，并将其插入带有谷脱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因的融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ上，转入大肠杆菌ＪＭ１０９中，ＩＰＴＧ诱导表达。融合蛋白（ＧＳＴ－ｓＣＴ）表达量占菌体总蛋白量的３８％～４０％。用亲和层析方法纯化该融合蛋白，达８０％电泳纯，降钙素酶联免疫试验呈阳性反应。这为生产重组ｓＣＴ进而研究它的功能和应用打下了基础。

鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达

用PCR的方法从含有鲑鱼降钙素基因的质粒中扩增出目的基因，并将其插入硫氧还原蛋白融合表达质粒pTrxFus中，转入大肠杆菌GI724，以色氨酸诱导，使之与硫氧还原蛋白融合表达，融合蛋白可占菌体总蛋白的50％左右。用超声破碎菌体后，上清直接上CM－SepharoseFF柱进行分离纯化，得到融合蛋白的纯度达90％以上。动物体内活力分析表明，融合蛋白有明显的降低血钙的作用，此工作为重组鲑鱼降钙素的开发应用和功能研究打下了基础。

人干细胞因子cDNA克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

以超速离心法提取的HepG2细胞总RNA为模板，应用RT-PCR技术扩增得到编码人干细胞因子（SCF）全长CDNA（约0.8kb）。克隆、序列分析确证编码人SCF膜外活性区的CDNA（约0.5kb）结构正确，构建了含有该基因的表达质粒（PBV-mhSCF）并在大肠杆菌中获得高效表达。

MiR-21通过抑制RECK表达促进胆管癌细胞QBC939的侵袭

目的研究miR-21在胆管癌组织及细胞系中的表达特征及其在胆管癌发生过程中的功能。方法用real-time PCR与Northern blot法分析miR-21在胆管癌组织及胆管癌细胞系QBC939中的表达;选择特异抑制剂Anti-miR-21敲低QBC939细胞内源性miR-21的表达,检测细胞增殖及凋亡表型;用萤光素酶双报告基因以及流式细胞仪分析法筛选并鉴定miR-21的靶基因;用体外侵袭实验分析miR-21对胆管癌细胞系QBC939体外侵袭能力的影响。结果 miR-21在胆管癌组织及胆管癌细胞系QBC939中表达均明显上调;QBC939转染Anti-miR-21后,抑制细胞增殖并促进细胞凋亡;miR-21可以抑制RECK的表达,并可以通过两者之间的相互作用,参与QBC939细胞系的体外侵袭调控。结论抑制miR-21的功能可以抑制胆管癌的进展。

人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物结构分析及活性研究

目的 确证人干细胞因子基因在大肠杆菌表达产物的正确性。方法 通过蛋白质杂交 ,氨基酸末端序列分析 ,质谱分析及动物体内生物活性的研究 ,对人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物———重组人干细胞因子 (rhSCF)分子进行了鉴定。结果 大肠杆菌表达产物rhSCFN端 15个氨基酸序列及C端 2个氨基酸序列与理论推测一致 ,产物的相对分子质量为 185 83.75 ,质量肽谱与理论序列的重叠率为 98.2 % ,动物试验亦表明当与粒细胞集落刺激因子 (G CSF)联用具有显著的外周血干(祖 )细胞动员作用。结论 人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物与理论推测完全一致 ,为其中试及临床试验奠定了基础。

重组人干细胞因子对猕猴外周血干细胞的动员作用

给正常成年猕猴每天一次皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子 10 μg·kg-1·d-1(μKD)或 (和 )重组人干细胞因子 2 0、5 0和12 5 μKD ,前者给药 5天 ,后者 8天 ,观察国产重组人干细胞因子动员外周血干细胞的效果。结果表明 ,给药后外周血白细胞数最高值rhG CSF单独给药组为 2 0 6 % ,rhSCF单独给药为 2 0 0 % ,而两者联合给药后为 2 80 %～ 310 % ;外周血CFU GM较动员前分别升高 1 1、1 3和 5 8～7 9倍 ;3个联合动员组外周血CD34+ 细胞数分别为动员前的 2 0、2 4和 35倍。说明rhSCF对外周血干 /祖细胞有明显的动员作用 ,rhSCF+rhG

重组鲑鱼降钙素前体多肽的制备及其性质研究

硫氧还原蛋白的第 38位 Met突变为 Ala的 Trx- s CT- Gly基因在 E.coli BL2 1 ( DE3)中得到高效表达 .用 Thio Bind亲和树脂纯化表达的融合蛋白 .结果说明 38位的 Met突变为 Ala不影响融合蛋白与树脂的特异性结合 ,融合蛋白的纯度达 90 %以上 .在含有 3mol/L尿素的 70 %甲酸中 ,室温 48h,至少 80 %融合蛋白被溴化氰裂解开 .采用 CM-纤维素吸附 ,用稀盐酸解吸附 ,得到纯度为92 %的降钙素前体多肽 s CT- Gly.氨基酸的序列分析结构表明 ,重组 s CT- Gly的 N端 1 0个氨基酸与预期一致 .在强酸性条件下 ,没有发生氨基酸的脱酰胺反应 ,氨基酸组成分析与预期基本一致 .质谱法测定的分子量为 3492 ,毛细管电泳测定的等电点 p I为 6.46,大鼠降钙素比活性为 1 90 IU/mg左右 ,与天然的人降钙素相当 .

两种新的激活γ珠蛋白基因的中药──盐酸山莨菪碱（654－2）和三尖杉酯碱

检测了３７种中药对Ｋ５６２细胞生长及血红蛋白合成的影响，发现盐酸山莨菪碱（６５４－２）和三尖杉酯碱可以使Ｋ５６２细胞的血红蛋白细胞增加３倍，细胞平均血红蛋白含量增加４倍，γ珠蛋白ｍＲＮＡ的表达分别增加５０％和４０％。电泳结果显示ＨｂＦ和γ珠蛋白肽链。

人干细胞因子受体膜外区1～3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性

目的 在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体（c-Kit）配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域（c-Kit/Ig1～3）,研究其配体结合活性.方法 采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段（c-Kit/Ig1～3DM）,构建pET16b-c-Kit/Ig1～3DM表达质粒,转化E.coli BL21（DE3）诱导表达,稀释复性,镍柱纯化.将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1～3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293 ET细胞构建c-kit/Ig1～3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白.His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性.结果 在大肠杆菌中c-Kit/Ig1～3^DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低.在HEK293 ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1～3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58 000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1～3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9.39 nmol/L.结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1～3融合蛋白.