来源于超嗜热古菌雅氏火球菌(Pyrococcus yayanosii)CH1耐热耐压脯肽酶的酶学性质研究

【目的】脯肽酶是一种能从二肽(Xaa-Pro)的C末端水解脯氨酸或羟脯氨酸残基的肽酶。对深海来源的雅氏火球菌(Pyrococcus yayanosii)CH1基因组中PYCH_07700基因编码的蛋白Pyprol的体外酶学性质进行研究,以期发现新型脯肽酶。【方法】在小宝岛热球菌(Thermococcus kodakarensis)TS559中异源表达Pyprol。使用二肽Met-Pro作为底物,检测重组蛋白的脯肽酶活性。【结果】Pyprol的最适温度为100℃,最适pH为6.0。Pyprol在与Co^(2+)结合时活性最高,最适的金属离子浓度为1.2 mmol/L。与P.furiosus来源的脯肽酶Pfprol相比,Pyprol在更宽的pH范围具有活性,并且能够耐受更高浓度的金属离子。Pyprol是耐压蛋白,最适静水压为40 MPa。与常压条件下相比,40 MPa下,Pyprol在40、70和100℃均有更高的活性。【结论】来源于深海热液喷口的严格嗜压的超嗜热古菌P.yayanosii CH1的新型脯肽酶Pyprol具有热稳定和耐压特性。

基于内源Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统构建超嗜热火球菌Pyrococcus yayanosii A1的基因敲降系统

【目的】亚氏火球菌(Pyrococcus yayanosii)A1菌株的最适生长温度为98℃,最适生长压力为5.2×10^(4) Pa,是研究此类严格厌氧、超嗜热和兼性嗜压古菌的环境适应性机制的良好材料。本研究基于P.yayanosii A1基因组中Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统,旨在建立可应用于此类古菌的基因表达敲降系统(gene knock-down system)。【方法】人工构建的mini-CRISPR簇,由内源性CRISPR簇Group 1的重复序列(repeats)和待敲降的淀粉酶基因(PYCH_13690)中的原间隔序列(protospacer)组成。将该mini-CRISPR簇插入到具有辛伐他汀抗性的穿梭载体pLMOShhp中,使之转录与目的基因mRNA匹配的crRNA,引导Cmr复合物对其进行切割。【结果】使用高静水压(HHP)诱导型启动子Phhp诱导mini-CRISPR簇表达时,淀粉酶基因的mRNA数量在5.2×10^(4) Pa静水压时下调到原来的67.05%,在1.0×10^(2) Pa静水压时下调为原来的49.69%;而使用组成型启动子Phmtb诱导mini-CRISPR簇表达时,淀粉酶基因的mRNA数量在5.2×10^(4) Pa静水压时下调为原来的58.48%,在1.0×10^(2) Pa静水压时下调为原来的23.97%。使用鲁戈氏碘液显色法对这两类基因表达敲降突变菌株的培养物中残留的淀粉含量进行分析,结果显示突变菌株的淀粉降解能力明显降低。【结论】在P.yayanosii A1中建立了基于内源Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统的基因敲降系统,可以用于抑制此类超嗜热嗜压古菌体内基因的表达。