两株马立克病病毒的分离及相关致病基因序列的比较

为了解国内鸡群马立克病（MD）流行毒株的遗传特征,采用细胞培养、间接免疫荧光等方法从江苏省2个鸡场送检病鸡中分离鉴定出2株马立克病病毒（MDV）Ⅰ型毒株,采用PCR方法扩增两分离毒株的vIL-8、pp38、meq等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比较分析。结果显示,两分离毒株的序列同源性为99.7%-100%,与MDVⅠ型强毒及超强毒株的同源性为99.3%-99.8%,具有强毒特征;两分离毒株的meq基因与其他4个国内分离强毒株的序列完全一致,在pp38基因编码的氨基酸序列中第109位均为甘氨酸而不是国外GA等毒株的谷氨酸,这与以前报道的另外3个中国野毒株一致。提示,这些变异可能是国内MDV流行强毒的遗传性特征。

鸡内参基因β-actin和GAPDH实时定量PCR重组质粒标准品的构建

本研究从SPF鸡皮肤中提取总RNA,并反转录为cDNA;以该cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增出看家基因β-actin和GAPDH,将PCR产物连入pGEM-Teasy载体,转化DH5α菌,经蓝白斑筛选和质粒酶切鉴定和DNA含量测定,得到定量的β-actin和GAPDH基因融合的重组质粒(pGEMT-actin和pGEMT-GAPDH),即实时定量PCR内参标准品。构建成功的标准品经10倍梯度稀释,作为模板,获得扩增效率良好及可信度高的标准曲线。构建成功的标准品可大量制备,可用于鸡的靶基因定量PCR所需的内参标准品。

蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定

目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白(GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究。方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a(+);在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性。结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性。结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究。

双向电泳分析鸡羽髓蛋白组学方法的建立

为建立双向电泳方法研究鸡羽髓蛋白组学,以进一步了解病毒与宿主相互作用的新机制,从SPF鸡羽根挤出羽髓,提取其中蛋白进行双向电泳,并对不同裂解液、IPG胶条pH值范围、一向等电聚焦条件、二向SDS-PAGE凝胶浓度等影响因素进行优化。结果显示,采用17cm,pH5~8IPG胶条,400μg羽髓蛋白进行的双向电泳,图谱用PDQuest8.0.1分析,可分辨的蛋白点约为700左右,不同样本间的匹配率大于80%。可见,本研究建立的双向电泳方法分辨率及重复性均较高。

实时定量PCR法在肝癌细胞β_2 M mRNA检测中的应用

目的探讨实时定量PCR法检测肝癌细胞β2微球蛋白(β2M)mRNA的应用价值。方法采用2-ΔΔCT定量PCR法检测肝癌SMMC 7721细胞株β2M mRNA表达水平。结果预实验确定目的基因(β2M)和内参基因(β-actin)的扩增效率较为一致。肝癌细胞中β2M基因表达水平明显低于正常肝细胞株L02(P<0.05)。结论2-ΔΔCT定量PCR法为定量检测肝癌细胞β2M基因的较好方法;可用于β2M在肝癌细胞中表达调控的研究。

引入课堂应答系统 “唤回”学生注意力

互联网时代,大学生在课堂上被各种网络媒体吸引而导致注意力不集中的现象越来越普遍。为"唤回"学生注意力,亟须改进教学模式。课堂应答系统利用现代信息媒体教学技术,可随时在课堂上对学生提问、考核,促进了教师和学生的直接互动。引入课堂应答系统可激发学生学习的积极性,迫使学生的注意力回到课堂。学生注意力回到课堂又可激发教师的教学热情,从而提升教学效果和学习效率。

雏鸡法氏囊蛋白质组学双向电泳技术的建立及其初步分析

为了建立并优化鸡法氏囊蛋白质组学的双向电泳技术体系,以不同日龄雏鸡的法氏囊组织为研究对象,用固相pH梯度胶条进行等电聚焦、SDS-PAGE垂直电泳,采用不同的样品制备方法,对上样量、水化、等电聚焦、胶条平衡和凝胶染色方法等进行一系列优化,并应用PDQuest8.0.1软件对图谱进行初步分析。结果显示法氏囊组织在pH 5~8范围1、7 cm的2-DE胶上可以得到很好的分离,胶体考染后经PDQuest软件分析,在正常法氏囊组织可检测到800个以上蛋白点,不同2-DE图谱间蛋白点平均匹配率为83.5%,不同日龄雏鸡法氏囊存在有明显表达差异的蛋白质点37个,其中表达上调蛋白点17个,表达下调蛋白点11个,新增蛋白点5个,消失蛋白点4个。试验建立的鸡法氏囊组织蛋白质组双向电泳技术为法氏囊发育进化及其免疫功能的研究提供了新技术和方法。

血管活性肠肽对胶原诱导关节炎大鼠治疗的作用初探

目的探讨血管活性肠肽(VIP)对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的免疫调节作用,为应用VIP治疗类风湿关节炎(RA)提供理论依据.方法采用尾根部皮内多点注射法注射天然Ⅱ型胶原(CⅡ),免疫雌性Wistar大鼠(60只),建立CIA模型.随机取CIA成模大鼠(5只/组)于初次免疫后14～35 d,腹腔内注射不同浓度的VIP.定期进行临床、实验室、影像学及病理指标评估.结果不同剂量VIP (0.1、 1、 5 nmol隔日1次,共2周)治疗后CIA大鼠,其临床、实验室、影像学及病理指标明显缓解;正常鼠于VIP给药5 nmol 2周后重要脏器功能、组织学未见明显异常.结论生理浓度的VIP体内可缓解CIA鼠关节局部及全身免疫炎性反应,5 nmol 2周以内的体内治疗量基本安全,提示VIP可作为治疗RA有潜力的制剂.

秀丽线虫野生株系和缺氧敏感株系的差异蛋白质组学研究

目的研究秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)野生株系N2和缺氧敏感株系(ia04)的差异蛋白质,为进行线虫在缺氧环境下的应答机制研究奠定基础.方法同步化培养2种株系的线虫,培养至L4期时,常规方法提取总蛋白,采用双向电泳分离和串联质谱分析,搜索Swiss-Prot线虫数据库,鉴定蛋白种类并根据基因本体论(gene ontology,GO)进行分析.结果质谱成功鉴定了其中的25个差异显著蛋白(ratio>2.0,P<0.05),其中N2株系检测到的表达量比ia04株系高的主要是热休克蛋白(HSP-70,HSP-60)、GTP结合蛋白(TAG-210)、乙酰辅酶A脱氢酶中链(GN=T);ia04株系检测到的表达量比N2高的是延伸因子(EFT-3)和铁硫蛋白-1(ISP-1),在ia04株系中,HSP的含量明显低于N2株系,说明这可能是ia04株系对缺氧敏感的原因之一.根据GO注释结果发现,鉴定到的这些差异蛋白与线虫的DNA合成及生长发育的相关性较大.结论蛋白质组学的方法为线虫缺氧的研究提供了有参考价值的数据,不同株系差异蛋白的发现可促进对缺氧应答机制的了解,且可从蛋白质水平揭示重要表型的基因表达机制.

晶胞接种法在肌动蛋白和木聚糖酶结晶中的应用

晶胞接种法(seeding technique)包括微晶胞接种法(micro-seeding technique)和大晶胞接种法(macro-seeding technique).微晶胞接种法主要用于改善晶体的衍射质量.大晶胞接种法主要用于得到大体积晶体以提高衍射分辨率,尤其是晶体的中子衍射分辨率.本文采用连续多次微晶胞接种法极大地改进了肌动蛋白(actin)晶体的衍射质量,获得的单晶X-光衍射分辨率达到1.9.本文丰富了大晶胞接种法的内容,以此技术获得了体积达到2立方毫米的木聚糖酶(xylanase)巨大单晶,其中子衍射分辨率达到了2.0,从而为它的第一个中子衍射晶体结构的解析奠定了坚实的基础.

紫萁多糖抗菌活性初步研究

本文报告了从紫萁中分离到的紫萁多糖，对金黄色葡萄球菌和藤黄色八叠球菌均有一定的抑制作用。作者根据祖传秘方的配制工艺和使用方法，将紫萁多糖应用于临床外科烧烫伤的治疗，发现其抗菌消炎的作用优于应用原药的治疗效果；临床试用的效果优于体外平皿实验效果。

石菖蒲对富营养化水体的净化效应

石菖蒲的生态地理分布十分局限，曾被认为是清洁水的指示植物．但经实验发现，该水生维管束植物可在污水中正常生长．通过测定石菖蒲的植株总氮、总磷以及养植石菖莆的富营养化水体的氯化物、有机物耗氧量、生化需氧量、溶解氧、铵氮、总磷、总氮等项指标。

马立克氏病病毒超强毒感染鸡羽髓蛋白质组分析

【目的】羽毛是细胞游离马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)释放的部位,为了解感染MDV后鸡羽中宿主基因表达的变化及对病毒感染的应答,进行了MDV感染鸡的羽髓蛋白质组学分析。【方法】1日龄无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鸡人工感染MDV超强毒RB1B株(1000PFU),感染后21d采集鸡羽毛,提取羽髓蛋白,以17cm,pH5-8的IPG胶条进行二维电泳,以未感染病毒的SPF鸡羽髓蛋白为对照,使用PDQuest软件对二维电泳图谱进行差异蛋白分析,并选取部分差异斑点进行质谱鉴定。【结果】PDQuest软件分析发现攻毒组和对照组表达差异大于两倍的蛋白点有41个,其中攻毒组表达上调的蛋白点25个,下调的蛋白点7个,新出现的蛋白点有9个。质谱分析共成功鉴定了21个斑点,对应于20个蛋白。如载脂蛋白AI(apolipoprotein AI)、14-3-3 sigma(两个斑点均为该蛋白)、癌蛋白18(stathmin)等。【结论】功能预测表明这些蛋白涉及到宿主的抗病毒应答、物质代谢、细胞骨架成分、细胞增殖相关等方面。

医学生物化学实验教学改革探析

实验教学对学生能力和素质的培养有着关键的作用,为了培养新一代创新型医学人才,医学生化实验教学必须根据时代的发展不断地进行改革。结合本院生化实验教学实际,从更新教学内容、改进教学手段,引进虚拟实验和提高实验人员素质等方面进行初步探讨,提高实验教学水平与质量。

人源NOVA1蛋白的真核表达及其抗低氧活性鉴定

构建人NOVA1基因的真核表达载体pCMV-Myc-NOVA1,转染PC12细胞后筛选最佳转染条件,进而结合细胞免疫组织化学研究NOVA1蛋白在PC12细胞中的表达分布,并探究其抗低氧活性。根据NCBI数据库NOVA1基因序列设计上下游引物,以pCR4-TOPO-NOVA1载体为模板采用聚合酶链式反应扩增获得NOVA1基因的全长c DNA编码序列,限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ双酶切后插入pCMV-Myc真核表达载体,酶切及直接测序验证后采用脂质体转染法转染入PC12细胞,针对转染比例和转染时间进行优化,进而采用实时定量PCR和Western blotting检测NOVA1蛋白的表达,最后采用细胞免疫组织化学检测NOVA1蛋白在PC12细胞中的表达定位及其抗低氧活性。通过酶切和直接测序验证,成功构建了真核表达载体pCMV-Myc-NOVA1;质粒和Lipo2000最佳转染比例为1:2.5,最佳转染时间为72 h;最佳转染条件下NOVA1基因和蛋白的表达水平显著增加,转染pCMV-Myc-NOVA1质粒后,NOVA1蛋白主要分布于细胞核和细胞质;过表达NOVA1的PC12细胞增殖活性明显增加。本文采用分子克隆的方法成功构建了NOVA1基因的真核表达载体,通过条件优化实现了高效表达并测定过表达NOVA1蛋白具有明显的抗低氧活性,不仅为深入揭示NOVA1蛋白的作用机理提供了重要参考,而且为NOVA1蛋白潜在的药物开发提供了重要技术支撑。

鼠脑驱动蛋白ATP水解机制的晶体学分析

鼠脑驱动蛋白是一类利用ATP水解释放的能量在微管系统上高连续性运动的常规驱动蛋白。了解ATP水解的化学能如何转化为机械动能是驱动蛋白研究中的重大课题。为此,鼠脑驱动蛋白单体(rK354)的晶体通过浸泡的方式引入ATP的结构类似物AMPPNP。rK354-AMPPNP复合物和rK354-ADP复合物结构的比较,揭示了开关区域Ⅱ的Glu237起连接ATP的γ-磷酸和驱动蛋白微管结合区的枢纽作用。

鼠脑驱动蛋白的表达、纯化和结晶

驱动蛋白是一类利用水解ATP为ADP和磷酸的过程中释放的能量沿微管系统运动的蛋白。为了研究ATP中储存的化学能是如何转化为驱动蛋白的机械动能,鼠脑驱动蛋白的相关N-端区域在BL21-Codon Plus(DE3)-RP感受态大肠杆菌细胞中大量地表达。通过SP-强阳离子交换色谱和分子筛色谱的两步骤纯化,蛋白最终产量高达10 mg/L细胞培养液,蛋白纯度可以达到95%以上。纯化的蛋白具有水解ATP酶的活力,并与驱动蛋白抗体有特异性的反应。驱动蛋白可以在如下条件结晶:1.7 mol/L(NH4)2SO4,500 mmol/L NaCl,20%glycerol。晶体衍射的分辨率可以达到2.0。