糖基转移酶WekM参与禽致病性大肠杆菌脂多糖合成和环境适应

【目的】研究O_(1)血清型禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的O抗原糖基转移酶WekM在脂多糖合成和环境适应中的作用。【方法】采用Red同源重组方法,构建APEC O_(1)菌株的wekM基因缺失株,并构建wekM回补株。随后分析wekM基因对APEC O_(1)菌株生长和运动能力的影响,通过银染和Western blotting鉴定细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)图谱以及与兔抗O_(1)血清的反应能力,通过实时荧光定量PCR测定细菌鞭毛相关基因转录水平,使用溴化乙锭测定细菌细胞膜通透性。最后,通过药敏试验检测细菌对环丙沙星等抗生素敏感性。【结果】PCR验证及DNA测序结果表明ΔwekM缺失株和回补株构建成功。银染鉴定ΔwekM缺失株较野生株LPS图谱不完整,部分O-抗原条带缺失;同时,Western blotting检测未见到ΔwekM与O因子血清的反应条带,这说明O-抗原糖基转移酶wekM基因缺失后影响LPS合成。生长运动能力分析显示,ΔwekM缺失株的运动能力较野生株显著减弱,生长速率与野生株一致。实时荧光定量PCR检测发现,ΔwekM缺失株的flgC等鞭毛相关基因转录水平降低,表明wekM基因影响细菌鞭毛的合成。此外,ΔwekM的细胞膜通透性较野生株显著增加(P<0.01),药敏结果也显示,ΔwekM缺失株较野生株对多黏菌素等7种抗生素敏感性增加,这说明wekM缺失后细菌细胞膜理化性质改变,适应环境的能力降低。【结论】本研究揭示了禽致病性大肠杆菌糖基转移酶wekM基因缺失导致细菌LPS完整性受损,运动能力降低,鞭毛合成受阻,鞭毛形成基因转录水平下降,细胞膜通透性增强,对抗生素敏感性增加。这些结果为解析wekM基因的功能奠定了研究基础,有助于深入了解禽致病性大肠杆菌O_(1)的环境适应机制。

硫氧还蛋白Lmo1903介导单增李斯特菌抵抗氧化应激的生物学功能研究

【目的】以单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)硫氧还蛋白Lmo1903为研究对象,研究其在细菌环境适应过程中的抗氧化应激生物学作用。【方法】使用生物信息学方法分析Lmo1903的进化关系和关键活性位点,使用酶切连接的方法构建Lmo1903蛋白表达载体,获得纯化的重组蛋白,以胰岛素为底物分析其氧化还原酶学活性;同时制备鼠源多克隆抗体,分析其在细胞内的定位;采用核苷酸定点突变技术构建CX1X2C基序中的半胱氨酸点突变蛋白,分析关键位点半胱氨酸对Lmo1903酶活的影响;采用同源重组原理构建lmo1903基因缺失株Δlmo1903和回补株CΔlmo1903,研究lmo1903在单增李斯特菌生长、运动和抗氧化应激方面发挥的功能。【结果】生物信息学分析显示,Lmo1903含有CX1X2C基序,与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的TrxA的亲缘关系较近,属于硫氧还蛋白家族成员,主要定位在细菌细胞质中,具有较强的还原酶学活性,突变CX1X2C基序中的半胱氨酸残基会显著降低Lmo1903的还原酶活能力。缺失lmo1903不影响单增李斯特菌的生长能力,但显著减弱了细菌在铜离子胁迫环境中的氧化应激耐受能力,且影响鞭毛合成相关因子的转录水平和细菌的运动能力。【结论】本研究首次证实了单增李斯特菌硫氧还蛋白Lmo1903具有还原酶学活性,介导细菌运动和对氧化环境的适应。

单核细胞增多性李斯特菌硫氧还蛋白Lmo1609的应激生物学功能研究

【目的】本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)硫氧还蛋白Lmo1609的基因缺失株,分析Lmo1609的氧化还原酶学活性,及其在细菌生长、运动过程中发挥的作用,并探究了Lmo1609参与细菌抗氧化应激和致病的生物学基础。为阐明其抗应激生物学作用以及完善李斯特菌的感染机制奠定分子基础。【方法】利用同源重组原理构建lmo1609基因缺失株及回补株。通过分子生物学、应激生物学和感染生物学等手段,对Lmo1609的生物学功能进行探索。以胰岛素为底物分析其氧化还原酶学活性;通过构建lmo1609缺失株和回补株,比较野生株和突变株在运动性、生长能力、抗氧化应激、细胞黏附、侵袭和增殖能力等方面的差异,进而鉴定Lmo1609的生物学功能。【结果】缺失lmo1609后,单增李斯特菌在生长能力上无明显变化,而运动能力明显减弱;对H_(2)O_(2)的敏感性增强;对细胞的黏附侵袭能力没有差异;对小鼠的致病力没有显著影响。【结论】本研究首次证实了单增李斯特菌硫氧还蛋白Lmo1609具有还原酶学活性,参与调控细菌的运动和对H_(2)O_(2)的氧化应激耐受,不介导单增李斯特菌的致病性。