SYTO9／PI荧光探针标记的铜绿假单胞菌PAO1菌株生物被膜形成的动态观察

目的探讨铜绿假单胞菌细菌生物被膜(biofilm,BF)形成发展过程中空间立体结构变化。方法SYTO9/PI荧光探针标记PAO1菌株,体外建立6h、1d、3d及6d时间组铜绿假单胞菌PAO1菌株BF模型,激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)摄取BF形成发展各阶段不同层面的图片堆,经图像结构分析软件(imagestructureanaly-zer,ISA)分析获得PAO1菌株BF相关空间结构参数定量化数据。结果①CLSM结合SYTO9/PI荧光探针标记,实现了对PAO1菌株BF动态形成过程的观察。②随着BF形成时间的延长,各层死菌比例逐渐增加,且死菌多分布于微菌落中心。③ISA软件定量化分析显示,随着BF发展,厚度显著增加,前3d增加程度显著大于后3d;区域孔率显著下降趋势;平均扩散距离呈逐渐增加趋势;结构熵呈显著上升趋势。结论利用ISA程序结合SYTO9/PI荧光探针可以表征PAO1菌株BF的空间结构特征和BF各层细菌的生存状态。

绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析

目的探讨铜绿假单胞菌细菌生物膜(biofilm,BF)形成发展过程中空间立体结构变化,以及BF形成过程中与其生物学行为之间的相互联系。方法体外建立6h和1、3及6d等4个时间组铜绿假单胞菌PAO1菌株BF模型,通过绿色荧光蛋白(greenfluorescence protein,GFP)标记,结合激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)摄取BF形成发展各阶段不同层面的图片堆,经图像结构分析软件(image structure analyer,ISA)分析获得PAO1菌株BF相关空间结构参数定量化数据。结果1CLSM结合GFP标记,实现了对PAO1菌株BF动态形成过程的观察;2ISA软件定量化分析显示,随着BF发展,厚度不断增加,前3d增加程度(19.6μm)明显大于后3d(6.1μm),区域孔率(areal porosity,AP)、平均扩散距离(average diffusion distance,ADD)和结构熵(textural entropy,TE)在BF形成的6h和6d分别为:0.98±0.01和0.92±0.02,呈现下降趋势;1.00±0.009和1.06±0.027,虽变化幅度不大,但亦呈现逐渐增加趋势;0.7±0.08和4.3±0.09,呈明显上升趋势。结论ISA程序可以表征PAO1菌株BF的空间结构特征,对细菌BF结构的定量化分析也有助于探索BF形成过程与其生物学行为之间的相互联系。

细菌生物膜形成和耐药机制研究进展

细菌生物膜是一个具有结构性、协调性和功能性的高度组织群体,其相关感染因为对抗生素耐药性极强成为临床难治性感染的重要原因之一。本文参阅近年来国内外研究结果,介绍了细菌生物膜的结构及特性,重点讨论其形成发展,抗生素耐药机制及防治策略方面的研究进展,对于寻找有效控制手段,指导临床合理用药和开发新药有重要意义。

氨溴索对环丙沙星透过铜绿假单胞菌生物膜的影响

目的研究氨溴索对环丙沙星透过铜绿假单胞菌生物膜的影响。方法孔径为0.22μm的医用微孔滤膜建立铜绿假单胞菌生物膜的体外模型;用高效液相色谱(HPLC)方法测定环丙沙星透过生物膜的量,并测定在2和0.75mg/ml氨溴索作用后环丙沙星透过细菌生物膜的量。结果经过7d的连续培养后,铜绿假单胞菌可在微孔滤膜上形成均匀致密的生物膜。环丙沙星可缓慢透过细菌生物膜,8h左右达到平衡;2和0.75mg/ml氨溴索作用后可以明显增加环丙沙星8h内透过生物膜的量。结论以医用微孔滤膜为载体可建立铜绿假单胞菌生物被膜体外模型;氨溴索可以显著地促进环丙沙星对细菌生物膜的透过。

盐酸氨溴索联合环丙沙星抗铜绿假单胞菌成熟生物膜作用研究

目的构建铜绿假单胞菌发光菌株,建立铜绿假单胞菌生物膜(biofilm,BF)模型,研究盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌成熟BF的影响及与环丙沙星合用是否具有协同杀菌作用。方法将携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的质粒转染铜绿假单胞菌,平板培养法培养铜绿假单胞菌BF,建立铜绿假单胞菌BF体外模型,经盐酸氨溴索作用后,扫描电镜(scanning elec-tron microscope,SEM)观察盐酸氨溴索对BF形态结构的影响,荧光显微镜定性观察盐酸氨溴索对BF内活菌的作用,通过发光菌株荧光强度定量分析盐酸氨溴索单独作用以及与环丙沙星联用后BF内活菌量。结果盐酸氨溴索作用后电镜观察可见黏液样物变稀疏,不规则。盐酸氨溴索浓度大于0.49mg/mlBF内活菌数减少(F=18,P<0.05);盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用(F=15.1,P<0.05),且随着盐酸氨溴索浓度升高协同作用增强。结论盐酸氨溴索破坏铜绿假单胞菌成熟BF形态结构,减少其内活菌数;盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用,增强其杀菌能力。

丹参诱导鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞优化方案及电生理研究

分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),采用丹参对4～5代MSCs进行反复多次诱导分化及再分化,将其诱导分化为神经样细胞,倒置显微镜下连续观察形态学变化,通过免疫荧光细胞化学检测神经样细胞巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(neurofiliament,NF)、突触(小)泡蛋白(synaptophysin)的表达,采用细胞膜电位特异的荧光探针DiBAC4(3)标记细胞,激光扫描共聚焦显微镜动态监测细胞受高钾刺激前后的荧光强度变化,观察细胞电生理反应。结果显示:MSCs第1次经过丹参诱导2h后,MSCs伸出突起,向神经性细胞形态转变,此时巢蛋白表达率为(95.1±2.1)%(-x±s,n=3),基本不表达NF;随着诱导分化及去分化过程的次数增加,细胞分化为神经样细胞的时间缩短,突起拉长并交互缠绕呈复杂网状,MSCs第4次经过丹参诱导1h后,NF表达率(95.3±1.6)%(-x±s,n=3),并表达突触(小)泡蛋白,5h后突触(小)泡蛋白表达更为广泛;激光共聚焦扫描显微镜显示第4次诱导5h后的细胞在高钾刺激下发生去极化,胞内荧光强度瞬时增强,而MSCs空白对照对高钾刺激无反应。本优化诱导方案可以高效率地诱导MSCs分化为具有电生理特性的神经样细胞。

生命早期维生素D营养与儿童哮喘

喘息是儿童期常见的呼吸道症状,1/3的婴儿和超过1/2的学龄前儿童曾发生过喘息,部分发展成哮喘[1]。2010年国内儿童哮喘流行病学调查[2]显示,中国城区儿童哮喘总患病率为3.02%,比10年前上升52.53%。目前已经有诸多研究提示维生素D与哮喘的发生有关[3-4]。有研究表明,在生命早期1000天,即从受孕至生后2年,此期间的营养状况对于儿童期甚至成年期的健康状况具有至关重要的影响[5]。

孟鲁司特钠联合普米克令舒治疗小儿哮喘急性发作期临床疗效及对血清IL-17、TNF-α、hs-CRP的影响

目的探讨孟鲁司特钠联合普米克令舒治疗小儿哮喘急性发作期临床疗效及对血清白细胞介素17(IL-17)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)的影响。方法选择该院82例哮喘患儿作为观察对象,随机分为对照组和研究组,每组各41例。对比不同方案治疗对患儿的临床疗效、血清相关指标及肺功能的影响。结果治疗后研究组患儿的总有效率高于对照组患儿,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后两组患儿IL-17、TNF-α、hs-CRP水平与治疗前比较,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后两组患儿第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)、达峰时间比(TPTEF/TE)、达峰容积比(VPEF/VE)与治疗前比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用孟鲁司特钠联合普米克令舒治疗急性发作期小儿哮喘,可有效降低相关炎症因子水平,提升临床疗效,改善肺功能情况。

机械通气新生儿气管导管表面细菌生物膜的扫描电镜观察及其与下呼吸道感染的关系

目的观察气管导管(endotracheal tube,ETT)表面细菌定植及生物膜(biofilm,BF)形成,探讨其与机械通气新生儿伴发下呼吸道感染之间的相关性。方法以我院2005年1至6月,经治的20例机械通气新生儿为研究对象,观察机械通气过程中下呼吸道感染发生情况,收集第一次拔除或更换的 ETT,扫描电镜(Scanning Electron Microscopy,SEM)观察 ETT 表面 BF(ETT-BF)形成情况及结构,并对 ETT 表面和下呼吸道分泌物进行细菌分离、鉴定和药敏分析。结果①20例中13例机械通气前并不存在下呼吸道感染,在机械通气过程伴发了下呼吸道感染,并在整个机械通气期间持续存在;其中有9例 ETT 留置时间与机械通气时间一致(平均机械通气时间为3.6 d)。②SEM 观察发现留置时间超过1 d 的 ETT 表面细菌定植增加(12/20),3 d 左右细菌在 ETT 表面初步形成 BF,超过3 d 表面 BF 结构更加成熟复杂。③ETT 表面培养阳性14例(包括正常菌群4例),分离得到病原菌7种;下呼吸道分泌物培养阳性13例(包括正常菌群1例),分离得到病原菌10种;其中7例 ETT表面和下呼吸道分泌物同时分离得到同种菌种,其 ETT 留置时间为(3.2±1)d,占 ETT 培养阳性的50%。④ETT 表面和下呼吸道分泌物分离得到的 G^-细菌均对抗生素多重耐药。结论 ETT 表面细菌定植及 BF 形成与长时间机械通气新生儿伴发下呼吸道感染之间可能存在一定相关性,ETT-BF 可能是其感染持续存在的一个病原来源。

骨髓间充质干细胞移植改善缺氧缺血性脑损伤大鼠空间学习记忆的最佳时间

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)移植治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的最佳时间点。方法体外培养rMSCs传代至4～5代,同时建立新生鼠HIBD模型,分别在HIBD后2、24、72、144h进行腹腔注射移植,5周后行水迷宫行为学检测。结果水迷宫实验中,HIBD后2h移植组(A组)、HIBD后24h移植组(B组)、HIBD后72h移植组(C组)、HIBD后144h移植组(D组)、假手术组(E组)、HIBDPBS对照组(F组)逃避潜伏时间组间比较,E组及各移植组逃避潜伏时间均明显低于F组(P<0.05),A组低于B、C、D组(P<0.05),D组低于B组、C组(P<0.05)。各组平台象限泳距占总泳距的比例组间比较,E组及各移植组均明显高于F组(P<0.05),D组低于E组(P<0.05)、高于B组和C组(P<0.05)。结论 rMSCs移植可明显改善HIBD大鼠的空间学习记忆功能,在HIBD后2h进行移植效果较其他时间点好。

十例肺炎链球菌感染相关性儿童化脓性脑膜炎临床特征分析

目的：探讨肺炎链球菌感染相关性儿童化脓性脑膜炎的临床特点及对抗生素的耐药性,为早期诊断及合理治疗提供依据。方法收集重庆医科大学附属儿童医院神经内科于2008年1月至2013年1月收治的肺炎链球菌感染相关性儿童化脓性脑膜炎的临床资料,收集临床表现及细菌耐药情况等资料,并进行描述性分析。结果共10例患儿纳入分析,起病年龄在2.5个月～8.5岁,中位年龄为1.0岁。所有患儿均有感染中毒及颅内高压表现,3例年龄小于3岁患儿出现惊厥。10例患儿中,8例行药敏试验,对青霉素耐药者4例,对氯霉素耐药者2例,对美罗培南耐药或者中介6例,对头孢噻肟钠耐药或者中介5例,对头孢吡肟中介或者耐药4例,所有菌株均对万古霉素敏感。9例患儿使用万古霉素抗感染,平均使用时间为（18.0±8.1）d（10～38 d）,2例使用了氯霉素。10例患儿平均住院时间为（22.8±5.8）d（15～38 d）,出院时预后良好者9例,预后不良者1例。有6例发生了神经系统并发症,主要并发症为硬膜下积液（5例）。结论肺炎链球菌脑膜炎主要发生在婴幼儿,一旦确诊,应足量足疗程使用万古霉素抗感染,必要时予氯霉素,总体预后良好。其常见并发症为硬膜下积液,主要见于婴幼儿。