β_(2)肾上腺素受体在erastin诱导的前列腺细胞铁死亡和自噬中的作用及其机制

目的探讨β2肾上腺素受体(ADRB2)在铁死亡激活剂erastin(Era)诱导的前列腺癌细胞铁死亡、自噬中的作用及可能的分子机制。方法取慢病毒或对照感染的PC-3细胞,设置sh-NC组(正常培养)、sh-NC+Era组(10μmol/L Era处理24 h)、sh-ADRB2组(正常培养)与sh-ADRB2+Era组(10μmol/L Era处理24 h)。采用CCK-8法检测铁死亡激活剂Era和铁死亡抑制剂ferrostatin-1(Fer-1)处理后的细胞存活率,透射电镜观察细胞形态变化,丙二醛(MDA)检测试剂盒检测MDA含量,铁离子比色法检测铁离子含量。Western blotting检测胱氨酸谷氨酸转运体(XCT)、铁蛋白重链1(FTH1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)、p62、LC3、c-Jun N-末端激酶(JNK)、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达水平。注射ADRB2敲低的PC-3稳转株,构建裸鼠成瘤模型并用Era处理,分为sh-NC组、sh-NC+Era组、sh-ADRB2组与sh-ADRB2+Era组,每组4只。隔天记录瘤体体积及最终瘤体重量,并采用免疫组化检测ADRB2、JNK、c-Jun、p-c-Jun的表达情况。结果Era处理后PC-3细胞存活率下降(P<0.01),加用Fer-1处理后PC-3细胞存活率恢复(P<0.01)。透射电镜下可见,Era处理后PC-3细胞发生铁死亡和自噬形态学改变,MDA和铁离子含量增高(P<0.05或P<0.01);敲低ADRB2并用Era处理后PC-3细胞存活率进一步下降(P<0.05),MDA和铁离子含量进一步升高(P<0.01),FTH1、XCT、GPX4和LC3蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01),p62蛋白和JNK通路相关基因JNK、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达水平升高(P<0.01);JNK抑制剂处理后,FTH1、XCT和LC3表达水平升高,p62表达水平降低(P<0.01)。PC-3裸鼠模型中,sh-ADRB2+Era组瘤体体积明显小于sh-NC+Era组和sh-ADRB2组(P<0.05或P<0.01);免疫组化检测结果显示,与sh-NC组比较,sh-ADRB2组ADRB2蛋白表达水平降低(P<0.05),JNK、c-Jun和p-c-Jun蛋白表达水平升高(P<0.01);与sh-NC+Era组比较,sh-ADRB2+Era组ADRB2蛋白表达水平降低,JNK、c-Jun和p-c-Jun蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论ADRB2可能通过JNK/c-Jun通路调控前列腺癌细胞中Era诱导的铁死亡和自噬。

副交感神经M1受体通过Caspase-1/GSDMD通路调控前列腺癌细胞焦亡

目的探讨副交感神经M1受体(muscarinic acetylcholine M1 receptor, CHRM1)对前列腺癌细胞焦亡的影响及其可能的分子机制。方法在PC-3细胞中分别于12、24、48 h加入不同浓度CHRM1特异性抑制剂哌仑西平(pirenzepine, PIN)和激动剂氯贝胆碱(bethanechol, BECH),后用慢病毒感染PC-3细胞构建CHRM1敲低的稳转株,再用质粒转染构建成孔蛋白gasdermin D(GSDMD)的敲低细胞模型,CCK-8实验检测细胞增殖能力,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)细胞毒性检测试剂检测LDH释放水平,流式细胞术及荧光倒置显微镜下观察Hoechst-PI和Annexin V-PI双染后的PI阳性细胞率,通过透射电镜观察细胞焦亡现象,Western blot检测Caspase-1/GSDMD通路相关分子的表达水平。结果 CHRM1特异性抑制剂哌仑西平及慢病毒敲低CHRM1可使前列腺癌细胞PC-3细胞活力下降(P<0.05),PI阳性细胞数显著增加(P<0.01),同时在透射电镜下可观察到明显细胞焦亡现象,而相对的加入激动剂氯贝胆碱可使其细胞活力在一定浓度范围内上升(P<0.05),PI阳性细胞率减少(P<0.01);通过药物和慢病毒下调CHRM1之后,Caspase-1/GSDMD通路中的天冬氨酸蛋白水解酶-1 (Caspase-1)、天冬氨酸蛋白水解酶剪切体-1(cleaved Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、炎症复合体(NLRP3)及GSDMD水平明显上升(P<0.05);敲低GSDMD之后,PI阳性细胞率降低(P<0.05),LDH释放率降低(P<0.001),各相关蛋白水平显著下降(P<0.01),且抑制或敲低CHRM1后PI阳性细胞率、LDH释放率及各相关蛋白水平无明显回复。结论下调CHRM1可通过Caspase-1/GSDMD通路诱导前列腺癌细胞焦亡。

交感神经β2肾上腺素受体促进前列腺癌转移并抵抗肿瘤细胞的凋亡

目的探讨交感神经β2肾上腺素受体(β2 adrenergic receptor,β2AR)对前列腺癌细胞迁移、侵袭以及凋亡的影响。方法通过UALCAN数据库检索分析β2AR在人前列腺癌组织及癌旁组织中的基因表达水平及与患者年龄的相关性;通过免疫组织化学染色分析β2AR在29例前列腺癌组织中的蛋白表达水平。体外培养人前列腺癌细胞系PC-3、LNCaP,β2AR激动剂异丙肾上腺素(ISO,2μmol/L,24 h或1、12、24 h),β2AR抑制剂普萘洛尔(PRO,1μmol/L,24 h)处理细胞;β2AR RNAi慢病毒转染PC-3、LNCaP细胞,Western blot及RT-PCR分别检测β2AR的蛋白及mRNA水平。Transwell实验检测细胞迁移及侵袭。Western blot检测上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)相关标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和凋亡相关蛋白Caspase3、cleaved-Caspase3及PARP的表达;流式细胞仪检测凋亡率;透射电镜观测细胞凋亡情况。结果 UALCAN数据库检索结果显示β2AR在前列腺癌患者组织中的基因表达高于正常前列腺组织(P<0.05);β2AR在41~60岁与61~80岁患者组间的表达差异不显著。29例前列腺癌患者组织的免疫组化结果显示,高风险患者(Gleason评分≥7)组织中β2AR蛋白水平高于低风险患者(Gleason评分<7)(P<0.001);细胞迁移及侵袭实验中,ISO处理组细胞迁移和侵袭增加(P<0.01),E-cadherin表达下调,N-cadherin和Vimentin表达上调(P<0.05);而PRO处理组及下调β2AR的表达后,细胞迁移和侵袭减少(P<0.01),E-cadherin表达上调,N-cadherin和Vimentin表达下调(P<0.05)。细胞凋亡实验中,ISO处理组细胞凋亡率降低,Caspase3、cleaved-Caspase3、PARP的表达明显降低(P<0.05),而PRO处理组及下调β2AR的表达细胞凋亡率明显增高,且Caspase3、cleaved-Caspase3、PARP的表达增高(P<0.05)。结论β2AR能够促进细胞EMT的形成,增加前列腺癌细胞的迁移、侵袭能力,并且通过下调凋亡相关蛋白的表达,对细胞凋亡产生抵抗作用,从而促进肿瘤转移。

副交感神经M1受体促进前列腺癌转移并抵抗肿瘤细胞凋亡的研究

该文旨在探讨副交感神经M1受体(muscarinic acetylcholine M1 receptor,CHRM1)通过调节PI3K/AKT信号通路对前列腺癌增殖、转移以及肿瘤细胞凋亡影响的研究。选用Western blot、免疫荧光等方法检测CHRM1在前列腺癌细胞中表达情况。体外培养人前列腺癌细胞系PC-3、LNCaP、DU145,然后用CHRM1激动剂卡巴胆碱(CAR)及特异性抑制剂哌仑西平(PIN)处理细胞。用CHRM1 RNAi慢病毒感染细胞,构建前列腺癌CHRM1敲低的稳转株。选用CCK8细胞增殖实验、平板克隆实验、细胞迁移侵袭实验、流式细胞术检测及透射电镜观察等方法探究CHRM1在前列腺癌中增殖、转移和凋亡水平。最后,用Western blot方法检测敲低的CHRM1前列腺癌细胞中上皮间质标志物及PI3K/AKT信号表达水平。结果显示,CHRM1大量表达在前列腺癌各细胞系细胞中。CAR处理后细胞增殖能力、克隆形成水平、转移能力及抗凋亡能力提高,而PIN处理后其增殖能力、克隆形成能力、转移能力及抗凋亡能力降低。敲低CHRM1后,细胞的转移能力及抗凋亡能力降低,且电镜下出现凋亡小体。在细胞迁移与侵袭实验中发现其转移能力与肿瘤的上皮–间充质转化(EMT)有关。同时,CHRM1通过PI3K/AKT信号通路调控肿瘤细胞进程。该研究结果提示,CHRM1在前列腺癌细胞中调节PI3K/AKT信号通路促进,前列腺癌增殖、转移并抵抗肿瘤细胞凋亡。