表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6的一组基因的克隆

人源毒素源性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.Coil ETEC)是引起婴幼儿及旅游者腹泻的主要致病菌。ETEC的致病因子包括定居因子抗原 (Colonization factor antigens,CFAs)和肠毒素。大多数ETEC菌株均能产生抗原特异的菌毛,介导细菌与宿主小肠粘膜表面并在粘膜表面上受体的结合,使得细菌能定殖于粘膜表面并在粘膜的功能性清除中存活下来。已经报道的定居因子抗原包括CFA/Ⅰ,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅲ、CFA/Ⅳ(PCF8775)、PCF09和PCFO159等。CFA/Ⅰ和CFA/Ⅲ均由单一的菌毛亚基构成,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅳ则由多种表面抗原(colisurface antigen,CS)复合而成。所有的CFA/Ⅳ阳性菌株均表达CS6抗原,其中有些同时表达CS4或CS5抗原。CS4和CS5都是直径6～7nm的菌毛,能引起人和牛血红细胞的甘露糖抗性的凝集反应(MRHA)。迄今为止,没有观祭到CS6明显的菌毛结构,CS6也不能引起MRHA阳性反应。然而动物实验的结果表明,CS6是CFA/Ⅳ复合抗原中一种对定居作用最重要的抗原”,。本研究组已经通过分子克隆的手段获得了能分别表达CFA/Ⅰ和CS3抗原的重组菌株,用于人源ETEC疫苗的研究。本文报道了表达CS6菌毛抗原的DNA片段的克隆,并用免疫吸附制备的CS6抗血清测定了重组菌株表达的菌毛蛋白。

预防仔猪腹泻无抗性基因工程菌株的构建

以原来含热不稳定肠毒素B亚单位基因质粒DNA为载体,插入lacZ基因,构建了一个既能表达LT-B亚单位又能表达β-半乳糖苷酶的含四环素抗性基因的重组体。在该重组DNA的四环素抗性基因内再插入K88粘附因子抗原基因,从而灭活了四环素抗性基因。经测定该重组体能表达LT-B和K88两种抗原;lacZ基因取代四环素抗性基因,成为良好筛选标记。所构建的重组质粒能稳定存在。

ω-芋螺毒素MVIIC的N及C端修饰对折叠及活性影响

合成了 ω-芋螺毒素 MVIIC的三种 N及 C端修饰肽 ,应用高压液相色谱、CD及生物体内活性实验 ,研究了其 N及 C端修饰对折叠及活性的影响 .结果表明 :MVIIC N端用 Phe及 Ser修饰后降低其线性肽形成正确折叠的比例及结构的稳定性 ,对小鼠的脑室给药活性也相应降低 ;C端酰胺转为电负性羧基端后活性降低 ,CD谱存在显著差异 .

紫外线与过氧化氢对甲型肝炎病毒协同灭活效果的实验观察

以细胞感染法检测紫外线与过氧化氢对甲型肝炎病毒联合灭活的效果。结果，照射强度为３００μＷ／ｃｍ２的紫外线与１％过氧化氢联合作用５分钟，可将该病毒灭活９９．９４％。

甲型肝炎病毒PCR检测结果与其感染性关系的研究

据检测，以３００μＷ／ｃｍ２紫外线照射１０分钟，或用１％过氧化氢处理３０分钟，对甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）感染性的灭活率为９９．９９％，但用ＰＣＲ法未检出５＇端非编码区的扩增片段；经紫外线照时２０分钟，ＨＡＶ感染性虽全部消失，但仍可检出Ｐ１区扩增片段。结果表明，ＨＡＶ感染性的有无与ＰＣＲ扩增产物检出与否无平行关系．

表达大肠杆菌LT-B抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

采用无毒的鼠伤寒沙门氏菌SR-11 △Cya,ACrp,Aasd菌株作为宿主菌,选择相应的asd^+表达载体构建了含大肠杆菌肠毒素B亚基基因(toxB)的重组质粒,并通过两次转化引入宿主菌,构成了平衡致死的重组体。特异性的测定表明,这种无抗药性的杂合菌株能较高水平地表达LT-B抗原,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗的研究基础。

人产肠毒素大肠杆菌ST、LT-B肠毒素基因融合的研究

将人产肠毒素大肠杆菌(ETEC),编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码不耐热肠毒素B亚基(LT-B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联,ELISA检测融合基因表达蛋白产物观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。说明了ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性,这为产肠毒素大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。

广州市远郊九佛农村5岁以下儿童产毒性大肠杆菌(ETEC)腹泻的定点研究

1988年3月—5月在广州远郊九佛农村两个自然对342名不足5岁儿童的ETEC腹泻作定点研究。发生腹泻186人次,估算发病率为1.26次/人/年。检出病原体6种71株,检出率38％(71/186),依次为ETEC45株:轮状病毒和志贺氏菌各11株,气单胞菌2株,沙门氏菌和致病性大肠杆菌(EPEC)各1株。ETEC的三种肠毒素基因探针(热敏肠毒素LT,热稳定肠毒素ST-H和ST-P)的检测结果依次为16.2％(30/186)、3.7％(7/186)、1.7％(3/186),另外,同时具有二种肠毒素(LT+ST)的ETEC有5株占2.6％(5/186)。ETEC的抗药性普遍存在,多抗性尤为严重,最少的抗9种,最多的竟抗20种。LT阴性(LT-)菌的多抗性强度显著大于LT^+菌(P<0.05)。两种菌对痢特灵,呋喃妥因、床大霉素、卡那霉素都高度敏感,对青霉素、万古霉素、杆菌肽、新生菌素、麦迪霉索具有较强抗性。ETEC中存在7种耐药模式,其中3种为ETEC模式,4种志贺氏模式,这在国内未见报道,对深入研究志贺氏菌的耐药机理有实际意义。

α-芋螺毒素的研究现况

α-芋螺毒素是近年来研究得较多的一种海洋生物神经毒素,它特异性竞争结合烟碱型乙酰胆碱受体,化学结构独特。本文介绍有关α-芋螺毒素的种类、结构特征、生物学活性和制备方法等方面的研究进展及其在生物化学、生物学以及新药开发等方面的应用前景。

甲型肝炎病毒感染性灭活与抗原性破坏的比较

经比较，在３００μＷ／ｃｍ２紫外线照射下，ＨＡＶ颗粒感染性灭活速度远快于抗原性的破坏。经１％过氧化氢作用的ＨＡＶ颗粒，其感染性灭活速度与抗原性破坏速度基本呈平行关系，作用６０分钟，感染性消失，抗原性亦被破坏。

西藏地区沙门氏菌属的PCR检测及病原体耐药性研究

本文报告了以鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛素基因(flic)序列的一对各21mer为引物,采用聚合酶链反应(PCR)技术检测西藏高原地区(平均海拔3600m以上)采集的626例急性腹泻患者粪便标本。结果检出沙门氏菌阳性11株。经生化和血清学分型鉴定,确定其中3株为B群鼠伤寒沙门氏菌(S.typhi—murium);8株为C群中沙门氏菌(S.boris—morbificans)。11株沙门氏菌与29种常用药物药敏实验结果显示;16种药物敏感;13种药物均有不同程度耐药。耐药率高达63.6—100％,11株沙门氏菌呈现4—10种多重耐药性。

西藏地区急性腹泻侵袭性大肠杆菌的鉴定及药敏试验

本文对西藏四个地区的６２６例急性腹泻患者粪便进行了侵袭性大肠杆菌（ＥＩＥＣ）的基因探针检测与血清学分型鉴定。结果检出ＥＩＥＣ阳性７株，其中４株为０１６４：Ｋ血清型，２株为０２８ａｃ：Ｋ７３血清型，１株为０２９：Ｋ血清型。豚鼠角膜试验（Ｓｅｒｅｎｙ氏法）检测其侵袭力做为参比，有６株阳性，１株阴性。７株ＥＩＥＣ菌株与３７科抗菌药物药敏试验结果显示：其中２３种药物敏感，１４种药物均有不同程度耐药。７株菌中有６株呈现４～８种多重耐药。

应用DNA探针首次检出西藏高原地区ETEC—LT

产毒性大肠杆菌(ETEC)是引起感染性腹泻的一个重要病原菌。它产生两种肠毒素即LT和ST。80年代前后曾采用兔肠段结扎法和免疫溶血法等生物学、免疫学方法检测产毒性大肠杆菌(ETEC—LT)。国内于1986年报导了LT—DNA基因探针技术用于ETEC—LT的检测,并取得较好结果。

肠毒素大肠杆菌CFA/1重组质粒的高效表达及其结构与功能分析

肠毒素大肠杆菌(ETEC)是婴幼儿腹泻和旅游者腹泻的重要致病菌。每年因 ETEC引起腹泻而死亡的婴幼儿多达百万人。ETEC 腹泻主要是由于细菌通过菌体表面定居因子定居于宿主小肠上皮细胞上,然后大量繁殖产生肠毒素而引起的。定居因子抗原1(CFA/1)是一种优势血清型菌毛,其相应抗体在阻止病原菌在宿主小肠上定居起十分重要的作用。CFA/1基因位于60MDa 的质粒上,在此质粒上有两个区域为 CFA/1表达和菌毛装配所必需。含有 CFA/1结构基因的区域称之 CFA/1-1区,含有调节基因的区域称之 CFA/1-2区。由于 CFA/1-1区和CFA/1—2区相距25MDa。

西藏626例急性腹泻EIEC的基因探针检测及阳性株药敏试验研究

本文采用常规鉴定法和DNA探针技术,对西藏四个地区的626例急性腹泻患者粪便进行了侵袭性大肠杆菌(EIEC)的基因探针检测与血清学分型鉴定。结果检出EIEC阳性7株,其中4株为0164:k血清型;2株为028ac:k73血清型;1株为029:k血清型。豚鼠角膜试验(Sereng氏法)检测其侵袭力做为参比,有6株阳性:1株阴性。

毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6基因的克隆

通过构建人源毒素源性大肠杆菌野生株E519/66A大质粒的基因文库,成功地筛选出能表达定居因子抗原CS6菌毛的阳性克隆,初步确定了克隆DNA片段的限制性内切酶图谱。CS6抗原的编码和调控基因集中在一大小为4.6kb的DNA区段中,该片段能产生两种分子量大小不同、但抗原反应交叉的菌毛蛋白。本研究获得的CS6抗原阳性的重组菌株可用于人源ETEC多价疫苗的研制,克隆的基因片段亦可作为研究CS6菌毛蛋白基因表达及调控的基础。

5′端非翻译区对LT-B基因表达的影响

mRNA5＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT-B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的P_RP_L串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5＇端非翻译区的重组体。这些重组体分别在大肠杆菌HB101和DH5α中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联SD序列的LT-B基因的表达水平低于只有单个SD序列下的表达水平,而翻译偶联可使表达改善;用不同的SD序列LT-B基因的表达水平也有所不同,用基因本身SD序列可能要比用pBV220P_L启动子下游的SD序列好;在只含单个LT-B基因SD序列的重组体中,5＇端非翻译区序列的长短对LT-B基因表达没有什么影响;重组体在HB101中的表达水平高于在DH5α中的表达水平。

西藏高原地区急性腹泻病原菌的分布与耐药性研究

本文报告随机调查与采集西藏高原地区急性腹泻患者标本626份,采用基因探针和聚合酶链反应(PCR)技术方法与生物化学、血清学、动物实验等细菌学常规鉴定法相对比、相互补的平行研究方法,对腹泻病主要病原菌志贺氏菌、沙门氏菌、产毒性大肠杆菌(ETEC)、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、致病性大肠杆菌(EPEC)进行了菌型鉴定与耐药性研究。自626例患者标本中分离鉴定出118株病原菌,检出率18.85％(118/626),118株病原菌分别属于志贺氏菌87株(13.90％);沙门氏菌11株(1.76％);ETEC7株(1.12％);EIEC7株(1.12％);EPEC6株(0.96％)。 从29种药物药敏试验结果分析,西藏高原地区菌株的耐药性已接近或超过国内其它地区,菌株的耐药性涉及21种抗菌药物,大多数耐药株集中于8种最常用药物:强力霉素、磺胺、四环素、链霉素、复方新诺明、青霉素、红霉素、氯霉素。痢疾杆菌与沙门氏菌菌株多重耐药性严重,4种以上耐药菌株达100％。然而在病原性大肠杆菌中发现一些对多种药物敏感的原始流行菌株,其中一株侵袭性大肠杆菌(编号90240)对29种药物均为敏感。因此,本组腹泻病原菌耐药性研究结果提示:加强病原菌的耐药监测、合理使用药物对腹泻的治疗会起到积极作用;原始流行药敏菌株的研究、开发、利用,对微生物学、流行病学及疫苗的研制都有?

沙门氏菌作为疫苗载体的研究进展

沙门氏菌经过适当减毒仍能诱发机体的粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫;沙门氏菌作为疫苗载体的应用可能对肠道细菌的病原体、病毒病原体、原生和后生的寄生虫提供较广泛的保护性免疫。本文阐述了近几年来沙门氏菌减毒的研究以及作为疫苗载体的研究进展。