慢性HBV感染与代谢功能障碍基础研究:当前进展与争议

HBV被认为是一种“代谢病毒”,能影响多种代谢生命活动。慢性HBV感染与各种类型代谢功能障碍存在关联但仍无明确定论,对慢性HBV感染与代谢综合征、糖尿病、代谢相关脂肪性肝病等以代谢紊乱为特征的疾病之间相关性的机制仍知之甚少。目前主流观点认为,源自HBV基因组的HBx蛋白可能为HBV感染后介导机体代谢变化的重要环节,HBx可通过调节PPARγ、C/EBPα、SREBP和FATP2等蛋白的表达,影响机体糖、脂等物质的代谢,引起相关代谢功能障碍。非酒精性脂肪性肝病是代谢功能障碍在肝脏的最重要表现形式,由于其与HBV感染均可导致肝损伤,二者相互作用的研究备受关注,目前其关联仍存在较多争议,有待进一步探索。因此,本文详细阐述了当前慢性HBV感染与代谢功能障碍的相关研究进展,为后续的进一步研究提供思路。

肝硬化患者代谢特征及营养素与肝再生的关系

肝硬化患者疾病进展及并发症与营养状态密切相关,营养不良在肝硬化患者中的发病率相对较高,合并肌少症者预后更加不良,其代谢特征表现为营养物质摄入、吸收和合成代谢受阻,以及与肠道损耗增加和促炎细胞因子水平升高相关的高代谢消耗状态。临床早期识别不良代谢状态和及时干预对肝硬化患者疾病进展至关重要,包括葡萄糖、氨基酸和脂肪在内的营养素可能通过影响肝再生过程对肝硬化病程发生影响,相关机制复杂且值得进一步研究。通过营养素补充的干预方式,调控残存正常肝脏组织的再生能力,是否能够减缓甚或逆转肝硬化进程,提高生存率,是以后基础与临床研究的重要方向。本文就肝硬化患者的代谢特征及营养素与肝再生的关系做一评述,以供临床研究参考与借鉴。

粉防己碱上调Smad7表达抑制大鼠肝星状细胞活化

目的观察低浓度粉防己碱(Tetrandrine,Tet)对培养的大鼠肝星状细胞(HSC)活化和转化生长因子β1(TGFβ1)促活化作用的影响,并探讨该作用与TGFβ1受体后信号通路的关系。方法HSC原代培养,给予Tet(0.4、0.8、1.6和3.2μmol·L-1)处理,免疫细胞化学法检测α平滑肌肌动蛋白(αSMA)表达,或给予TGFβ1(质量浓度5μg·L-1)和(或)Tet(1.6μmol·L-1)干预,分别以RTPCR和Westernblot法检测TGFβ1及其Ⅰ、Ⅱ型受体、Smad3、Smad7以及αSMAmRNA和(或)蛋白表达。结果Tet(0.4～3.2μmol·L-1)能抑制培养HSC表达αSMA。Tet(1.6μmol·L-1)抑制TGFβ1诱导的HSCαSMA表达,伴有Smad7表达上调及TGFβ1表达下降,但不影响TGFβⅠ、Ⅱ型受体和Smad3表达。结论低浓度Tet抑制培养HSC的活化和TGFβ1促活化作用,该作用与上调Smad7表达并抑制TGFβ1有关而不影响TGFβ受体表达。

氧化苦参碱对转化生长因子-β_1促肝星状细胞活化及跨膜信号转导影响

目的 观察低浓度氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞 (HSC)培养活化和转化生长因子 - β1 ,(TGF - β1 )促活化作用影响 ,并探讨该作用与TGF - β1 受体后信号通路的关系。方法 原代分离培养 2dHSC ,MTT法检测低浓度氧化苦参碱 (0 .2 5～ 8mg/L)对HSC细胞毒作用 (作用 12h)和增殖影响 (作用 48h) ,或给予TGF- β1 (5ng/ml)和 /(或 )氧化苦参碱 (2mg/L)干预 ,相差显微镜观察HSC形态变化 ,分别以RT PCR或Westernblot法检测TGF - β1 及其Ⅰ、Ⅱ型受体、Smad 2 /3、Smad 7以及α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA)mRNA和 /(或 )蛋白表达。结果 氧化苦参碱 (0 .2 5～ 8mg/L)对HSC无明显细胞毒作用 ,大于 8mg/L能抑制HSC增殖。氧化苦参碱 (2mg/L)抑制TGF β1 诱导HSC激活时的α SMA表达和形态转化 ,伴随TGF β1 受体mRNA表达升高 ,Smad 7mRNA表达上调及TGF - β1 mRNA表达下降 (与单纯TGF - β1 处理组相比 ,分别上升 1.2 5、0 .87倍或下降 1.92倍 ,P均 <0 .0 5 ) ,但不影响TGF β1 Ⅱ型受体和Smad 3mR NA表达。Westernblot检测Smad 2 /3、Smad 7蛋白表达 ,与RT PCR结果相似。氧化苦参碱对单纯培养激活的HSC有类似作用。结论 低浓度氧化苦参碱 (2mg/L)上调Smad 7表达并抑制TGF β1 表达、上调TGF β1 Ⅰ型受体。

粉防己碱抑制肝星状细胞活化与转化生长因子-β信号转导关系

目的观察不同剂量粉防己碱对静止期大鼠肝星状细胞(HSC)活化的影响,以及该作用与转化生长因子-β(TGF-β)信号转导的关系.方法采用胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离正常大鼠HSC,培养48h后并给予不同浓度粉防己碱(0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L)处理.观察HSC形态学变化.采用免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达并进行图像分析;放射免疫法检测上清层粘连蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ);逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1、Smad 7 mRNA表达;Western blot法检测给予粉防己碱1.0mg/L处理的Smad 7表达.结果粉防己碱0.25～2.0 mg/L能抑制体外培养静止期HSC形态向成纤维细胞样转化;降低α-SMA、LN和PCⅢ表达;RT-PCR显示粉防己碱抑制HSC TGF-β1 mRNA表达,抑制率最高达87.85%(P＜0.01),同时上调Smad 7 mRNA表达,达对照组的2.4～5.8倍(P＜0.01),两者呈显著负相关(r=-0.755,P＜0.01).Western blot也显示,与对照组相比,粉防己碱(1.0 mg/L)显著上调Smad 7蛋白表达.结论粉防己碱能直接抑制体外培养的静止期HSC活化,该作用可能是上调Smad 7、影响TGF-β1信号通路并抑制TGF-β1表达的结果.

内源性AcSDKP及其前体胸腺素β4在四氯化碳致肝纤维化发生早期的变化

目的观察内源性AcSDKP及其前体胸腺素β4在四氯化碳致肝纤维化发生发展早期大鼠肝脏内的生理水平和动态变化。方法皮下注射四氯化碳的方法制备大鼠肝纤维化模型。在2周末和6周末处死动物,取血清检测肝功能指标,HE染色观察肝脏组织学变化;荧光定量PCR方法检测内源性AcSDKP的前体胸腺素β4水平和非特异性胸腺素β10水平;酶免疫分析方法检测肝组织匀浆中AcSDKP水平。结果四氯化碳皮下注射在2周末和6周末成功复制了肝损伤和早期肝纤维化模型;模型组肝组织胸腺素β4 mRNA水平在第2周和第6周表达均显著升高,分别为各自对照组的1.8倍(P=0.012)和5.9倍(P=0.003),而胸腺素β10的表达无变化;正常大鼠肝组织内生理性AcSDKP水平在实验第2周时(体质量359 g)为(3.77±0.29)nmol/g,实验第6周时(体质量349 g)为(4.10±1.20)nmol/g,两者差异无统计学意义;在肝损伤和肝纤维化发展早期,模型组肝组织内源性AcSDKP水平均显著下降,在第2周时较正常对照组下降28%(P=0.025),第6周时较正常组下降33%(P=0.042)。结论四氯化碳致肝纤维化发生发展早期大鼠肝脏内胸腺素β4升高显著而其水解产物AcSDKP显著下降,提示内源性AcSDKP分解代谢加速。内源性AcSDKP水平不足可能在肝纤维化发生发展早期起重要作用。

粉防己碱对大鼠静止期肝星状细胞细胞周期的影响

目的观察粉防己碱对大鼠静止期肝星状细胞(HSCs)细胞周期的影响及机制。方法分离正常大鼠HSCs,培养48 h后给予粉防己碱(1.6μmol/L)和(或)TGF-β1(5μg/L)处理3 d。流式细胞仪检测细胞周期分布;应用RT-PCR法检测Cyclin D1、Cyc-lin E、p21WAF1/CiP1和p27Kip1表达;使用Western blot法检测Cyclin D1和PPARγ蛋白水平。结果粉防己碱使G0/G1期和G2/M期细胞增多,S期细胞数显著减少,抑制TGF-β1介导的G0/G1期细胞含量下调和S期细胞含量升高,上调p21WAF1/CiP1mRNA表达,抑制Cyclin D1而维持PPARγ蛋白在一定水平。结论在静止期HSC中,粉防己碱通过抑制Cyclin D1、上调p21WAF1/CiP1和维持PPARγ表达使HSCs出现G0/G1期停滞和S期向G2/M期转换加速。

粉防己碱对肝星状细胞转化生长因子-β_1反应性影响

目的观察低浓度粉防己碱(Tetrandrine)对转化生长因子-β1(TGF-β1)促进静止期大鼠肝星状细胞(HSCs)活化和维持HSCs活化作用的影响,并探讨该作用与TGF-β1受体后信号通路的关系。方法HSCs原代培养,取静止期(培养3 d)和活化HSCs(培养8 d),给予TGF-β1(质量浓度5μg/L)和(或)粉防己碱(1.6μmol/L)干预,观察HSCs形态变化,分别以RT-PCR和Westernblot法检测TGF-β1、Smad7以及α-SMA mRNA和(或)蛋白表达。结果粉防己碱(1.6μmol/L)能抑制静止期HSCs胞体伸展,粉防己碱使活化的HSCs膜状伸展的胞体收缩和梭形变,在单纯粉防己碱处理组和混合处理组均可见此现象。在静止期和活化HSCs中,粉防己碱均能抑制TGF-β1诱导的HSCsα-SMA表达,TGF-β1表达下降,使静止期HSCs Smad7表达上调,但不影响活化HSCsSmad7表达。结论低浓度粉防己碱显著抑制TGF-β1对静止期的HSCs促活化作用和对活化HSCs的活化维持作用,诱导培养活化的HSCs活化逆转,其作用机制在不同活化状态的HSCs中存在差异。

肝星状细胞活化与细胞周期调控

肝星状细胞活化是肝纤维化形成的中心环节,目前尚未能完全阐明其复杂机制,近年研究发现该过程与细胞周期调控紊乱有密切关系。现对近年来 HSC活化和肝纤维化时 HSC细胞周期调控研究作一综述。

脂肪肝是否增加患心血管疾病风险

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）通常存在于代谢紊乱的机体环境中,这些代谢紊乱的表现包括体脂肪量提高、胰岛素抵抗、糖耐量受损和血脂异常。日积月累,这些因素增加患者心血管疾病风险,所以心血管疾病是NAFLD患者的主要死因,也就不足为奇。

2016年《实用肝脏病杂志》精彩回顾

在各位编委、审稿专家、作者、读者的关心和支持下，2016年我刊办刊质量和学术影响力进一步提高，作者地区分布全国29个省市，单期发行量达14000余册，诸多学术评价指标亦稳中有升。我刊2016年《中国科技期刊引证报告（核心版）》的影响因子（0．945分）在15种消化病学核心期刊中位列第5位，在1985种核心期刊中排名第293位。

复方鳖甲软肝片对乙肝肝硬化患者代偿期肝纤维化及炎性因子的影响

目的探讨复方鳖甲软肝片对乙肝肝硬化患者代偿期肝纤维化及炎性因子的影响。方法将76例乙肝肝硬化代偿期患者随机分为观察组和对照组,观察组采用复方鳖甲软肝片联合谷胱甘肽治疗,对照组仅给予谷胱甘肽治疗;对比分析两组治疗前后肝功指标、肝纤维化指标、炎性因子变化情况。结果肝功能指标:治疗后,两组患者的天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)降低,凝血酶原活动度(PTA)升高,差异有统计学意义(P<0.01);观察组患者的AST、TBil、ALT、PTA改善程度优于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。肝纤维化指标:治疗后,两组患者的层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)降低,差异有统计学意义(P<0.01);观察组患者的LN、PCⅢ、HA、Ⅳ-C低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。炎性因子:治疗后,两组患者的白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、内毒素(ET)降低,差异有统计学意义(P<0.01);观察组患者的IL-6、TNF-α、ET低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论复方鳖甲软肝片治疗乙肝肝硬化患者代偿期,可进一步减轻肝细胞炎症反应,缓解肝损伤,延缓肝纤维化进程,提高肝功能。

大鼠β_2m^-/Thy-1^+骨髓源性肝干细胞的体外分选及鉴定

目的尝试从骨髓干细胞(BMSC)中分选出具备干细胞和肝细胞双重特性的β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞(BDLSC)亚群,为细胞移植治疗肝病提供合适的供体细胞。方法利用免疫磁珠细胞分选(MACS)方法体外分选淤胆型大鼠模型的β2m-/Thy-1+BDLSC,流式细胞仪检测其纯度,RT-PCR法和免疫荧光染色法鉴定其肝相关性表型的表达。结果MACS法能成功分选纯化BDLSC,其在基因和蛋白水平均表达肝细胞样表型。结论β2m-/Thy-1+BDLSC是BMSC中较特异的肝干细胞亚群,具有可能益于肝病治疗的巨大潜力。

AcSDKP对大鼠活化HSCs增殖及分泌细胞外基质的影响

目的通过N-乙酰基-丝氨酸-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)干预,观察其对活化肝星状细胞(HSCs)的增殖以及合成和分泌细胞外基质(ECM)的影响。方法大鼠原代HSCs分离、培养和鉴定后,分别给予0.01、0.1、1、10、100nmol/LAcSDKP进行干预,设立空白对照组。MTT法检测AcSDKP干预对HSCs增殖的影响;RT-PCR技术检测活化HSCsⅠ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)mRNA表达;酶联免疫法检测培养细胞上清液透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量。结果与空白对照组相比,1、10nmol/LAcSDKP干预显著抑制活化HSCs的增殖;1、10nmol/L及0.1～100nmol/LAcSDKP的干预,分别显著抑制HSCsColⅠmRNA和ColⅢmRNA表达;0.1、1、10nmol/L和0.1、1nmol/LAcSDKP干预可分别显著抑制培养上清液HA和LN的表达。结论本实验发现,AcSDKP可抑制活化HSCs合成和分泌ECM,并呈现一定的剂量依赖性,以浓度为1nmol/L时作用最为显著。其作用机制可能与抑制HSCs增殖而使合成和分泌ECM的HSCs数量减少有关。

甘丙肽在高脂饮食诱导脂肪性肝病大鼠循环中动态变化

目的探讨甘丙肽在高脂饮食诱导脂肪性肝病大鼠循环中的变化,及其水平与脂肪因子相关性。方法高脂饲料喂养建立大鼠NAFLD模型,于第5、9和14周分别腹主动脉采血处死动物,留取血清与肝组织标本。HE染色观察肝组织病理学变化;ELISA法检测血清甘丙肽、瘦素、胰岛素、肿瘤坏死因子(TNF)-α、巨噬细胞趋化因子(MCP)-1和白细胞介素(IL)-1β水平变化;RT-PCR法检测肝脏组织甘丙肽及其受体在发病过程中变化;Spearman相关分析检测各节点甘丙肽与其他脂肪因子相关关系。结果病理显示,高脂饮食5周大鼠肝细胞脂肪变性明显,9周形成单纯性脂肪肝,14周出现明显脂肪性肝炎。与正常对照相比,血清甘丙肽在第5周和第14周均明显升高(P<0.05),而第9周时无差异。相关分析显示,第5周时,模型组甘丙肽与瘦素(r=-0.78)、胰岛素(r=-0.65)、IL-1β(r=-0.82)和TNF-α(r=-0.74)均呈显著负相关(P均<0.05),而与MCP-1呈正相关(r=0.70,P<0.05)。第14周,甘丙肽与瘦素(r=0.90)呈正相关,与胰岛素(r=-0.81)、TNF-α(r=-0.89)、MCP-1(r=-0.84)、IL-1β(r=-0.79)呈负相关。RT-PCR结果显示,GalR2 mRNA仅在14周大鼠肝组织中表达。结论大鼠血清甘丙肽在高脂饮食诱导肝脂肪变早期显著增高,在单纯脂肪肝形成时降至正常,而至脂肪性肝炎阶段再次升高并伴随GalR2重新表达。升高的甘丙肽水平与瘦素、MCP-1等炎性脂肪因子呈密切相关关系。甘丙肽可能通过调节脂肪因子水平与相关炎症反应等参与NAFLD发病。

腺病毒介导的人uPA体外转染大鼠骨髓源性肝干细胞的研究

目的评价携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染骨髓源性肝干细胞(BDLSC)的效率,在BDLSC中的表达及其对BDLSC增殖和分化的影响。方法利用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清病理条件培养液筛选和扩增BDLSC,采用荧光显微镜检测AduPA的转染效率,采用Westernblotting法检测uPA在BDLSC中的表达,采用MTT法和免疫细胞化学法分别检测转染AduPA的BDLSC的增殖和分化变化。结果随着MOI的增高,转染效率明显增高,当MOI为500时,转染效率达92.6±2.2%,转染3天后的人uPA在BDLSC稳定表达,且转染AduPA对BDLSC的增殖和分化无明显影响。结论BDLSC可能是一种良好的基因载体细胞,可携带uPA用于肝纤维化的治疗研究。

腺病毒介导的白介素10基因体外转导大鼠β_2m-/Thy-1^+骨髓源性肝干细胞

目的研究腺病毒介导的白介素10(interleukin 10,IL-10)基因(AdIL-10)体外转导β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞(bonemarrow-derived liver stem cell,BDLSC)的可行性。方法利用免疫磁珠细胞分选(magnetic bead cell sorting,MACS)方法分选大鼠β2m-/Thy-1+BDLSC,RT-PCR法鉴定其肝相关性表型的表达。AdIL-10转导BDLSC,根据腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达率测定转导效率,采用RT-PCR法和ELISA法分别检测IL-10的基因表达和蛋白分泌水平。采用MTT法和免疫荧光染色法分别检测腺病毒转导对BDLSC增殖能力和肝细胞样表型白蛋白(albumin,ALB)表达的影响。结果MASC法能成功分选纯化BDLSC,其在基因水平表达肝细胞样表型。AdIL-10转导BDLSC的效率呈剂量依赖性,最佳转染复数为500pfu/cell。AdIL-10修饰BDLSC高表达IL-10基因,且持续高浓度分泌IL-10蛋白至胞外。AdIL-10转导72h后,BDLSC仍保持正常的增殖能力和ALB表达。结论BDLSC是AdIL-10转导的适宜载体,为AdIL-10修饰BDLSC这一新型结合方式用于慢性肝病的治疗奠定了实践基础。

AdIL-10对肝星状细胞α-SMA、TGF-β1及TNF-α表达的影响

目的应用携带大鼠白介素-10(IL-10)基因的重组缺陷型腺病毒(AdIL1-0)感染原代培养的大鼠肝星状细胞(HSC),通过体外实验观察外源性大鼠IL-10基因对HSC中αSMA、TGF-β1和TNFα表达的影响。方法以胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离大鼠原代HSC,并用AdIL10感染HSC(同时设AdGFP对照组及正常对照组),分别采用RTPCR法和WesternBlot法检测感染后HSC中IL10mRNA及蛋白水平的表达;WesternBlot法检测HSC中转化生长因子β1(TGF-β1)及肿瘤坏死因子α(TNFα)的表达;免疫组织化学法检测αSMA在HSC中的表达。运用图像处理系统对结果加以分析。结果感染AdIL10的HSC中IL10的mRNA及蛋白水平均较对照组上调(P<0.001);而其表达的TGFβ1、TNFα及αSMA与对照组相比明显降低(P均<0.001);正常对照组和AdGFP对照组中上述指标的表达均无明显差异(P均>0.05)。结论外源性大鼠IL10基因导入大鼠HSC后可能通过影响TGFβ1及TNFα的表达而抑制HSC的活化。

新型Smad7重组腺病毒载体的构建

目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7)。方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-Smad7,线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组,鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7。RT-PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况。结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3 d可观察GFP明显表达;RT-PCR检测证实Smad7表达增强。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7,为进一步研究TGFβ信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础。

骨髓干细胞在肝纤维化治疗中的作用机制

近年来,骨髓干细胞(bone marrow stem cell,BMSC)在肝纤维化中的应用研究日益增多,显示出一定的抗肝纤维化作用,但具体机制尚不明确.众多研究结果显示,BMSC可能主要从两方面发挥抗肝纤维化作用,一是通过分化为功能性肝细胞、分泌生长因子和增强内源性肝细胞增殖来促进肝再生,二是通过分泌抗纤维化细胞因子、影响肝星状细胞和表达基质金属蛋白酶-9来抑制肝组织纤维化的形成.本文对骨髓干细胞在肝纤维化治疗中可能的作用机制作一系统阐述,为从事骨髓干细胞移植治疗肝纤维化的研究者提供借鉴和指导.