流式细胞术在精子功能检测中的应用

目的:研究流式细胞术在精子功能评价中的作用。方法:对104例男性不育患者和10例正常生育男性的精液标本进行精液量、精子密度、活动率、畸形率等精液常规分析(CASA法),对精子存活率、染色质结构和线粒体膜电位等进行流式细胞术分析,并将检测结果通过SAS软件进行统计学分析。结果:成组U检验结果表明:不育患者的精子与正常生育男性精子相比除了具有密度低(U=2.51,P=0.014 3)、活动率差(U=3.44,P=0.001)、畸形率高(U=-5.88,P<0.000 1)等特点外,经流式细胞术测定精子结果表明不育男性的精子质膜完整率(U=4.72,P<0.000 1)、线粒体膜电位正常率(U=-2.53,P=0.030 9)和染色质完整率(αt:U=-3.82,P=0.000 3;SDαt:U=-3.98,P=0.000 1;COMPαt:U=-3.57,P=0.000 5)均显著低于正常生育男性。多元逐步回归分析结果表明:精子质膜完整性与精子活动率(t=1.66,P=0.101 6)、精子的线粒体膜电位与精子活动率(t=3.33,P=0.001 4)、精子染色质的完整性与精子活动率(t=3.24,P=0.001 9)均呈正相关,而精子的线粒体膜电位与精子颈、尾部的畸形率呈负相关(t=-3.44,P=0.001)。结论:流式细胞仪测定对精子质量评定意义显著,对男性不育的诊断和治疗也具有较高的参考价值。

细胞周期和bcl-2、bax表达与脑胶质瘤病理分级的相关性研究

目的:探讨细胞周期和凋亡相关蛋白bcl-2和bax与脑胶质瘤病理分级的相关性,为脑胶质瘤严重程度的临床评价和机制研究提供参考依据。方法:取99例脑胶质瘤组织,分离获得单个胶质瘤细胞,采用FCM进行细胞周期和bcl-2及bax的测定,同时收集相应的病理分级资料,进行相关性分析和多元逐步回归分析。结果:病理分级与细胞周期(S期)及bcl-2、bcl-2/bax均呈正相关性,随着脑胶质瘤病理分级程度的升高,S期比例上升(t=2.48,P=0.018 4,R2=0.90),bcl-2、bcl-2/bax比值均上升(t=23.26,P<0.000 1,R2=0.93;t=27.42,P<0.000 1,R2=0.85)。结论:细胞周期S期分析和bcl-2、bcl-2/bax在脑胶质瘤严重程度的临床评价和机制研究中具有一定的参考价值。

2种隐瘢痕腹腔镜胆囊切除术的比较研究

目的探讨三孔法隐瘢痕腹腔镜胆囊切除术(laparoscopic cholecystectomy,LC)的有效性和安全性。方法 2008年8月～2010年4月70例良性胆囊疾患随机接受2种隐瘢痕LC,其中三孔法35例,单孔法35例。比较2种隐瘢痕LC的手术时间、术中出血量、术后住院时间、住院费用、术后疼痛和美容效果。结果三孔组术中出血量(21.3±11.8)m l与单孔组(24.3±11.2)m l相比无显著差异(t=1.091,P=0.270);三孔组术后住院时间(1.5±0.6)d与单孔组(1.5±0.7)d相比无显著差异(t=0.000,P=1.000);三孔组住院费用(8639.6±617.4)元与单孔组(8631.2±810.7)元相比无显著差异(t=-0.049,P=0.961);三孔组术后第2天VAS评分为(1.1±0.4)分与单孔组(1.2±0.4)分相比无显著差异(t=-1.046,P=0.299);三孔组美容满意度评分(1.1±0.4)分与单孔组(1.1±0.3)分相比无显著差异(t=0.000,P=1.000)。三孔组手术时间(15.1±5.9)m in比单孔组(45.5±11.0)m in明显缩短(t=14.408,P=0.000);三孔组术后第1天VAS评分(2.9±1.4分)比单孔组(4.6±2.0)分显著降低(t=-3.985,P=0.000)。65例(三孔组33例,单孔组32例)随访6～24个月,平均13个月,均无并发症。结论三孔法隐瘢痕腹LC是一种安全和有效的术式。

经腹白线腹腔镜胆囊切除术:一种新的隐瘢痕胆囊切除术式

目的:通过与经脐腹腔镜胆囊切除术相比,验证经腹白线腹腔镜胆囊切除术在避免术中器械干扰、减轻术后疼痛和美容效果等方面的优越性。方法:随机将患者分为2组:经腹白线腹腔镜胆囊切除(translinea alba laparoscopic cholecystectomy,TLLC)组20例,经脐入路腹腔镜胆囊切除(transumbilical laparoscopic cholecystectomy,TULC)组18例。两组均采取3孔法。前者2个5mm戳孔在脐部,1个5mm戳孔位于耻骨正上方1～2cm处。后者3个5mm戳孔均在脐部。比较两组的手术时间、手术并发症、术后VAS疼痛评分、术后住院时间、美容效果满意度等。结果:38例手术均获成功,无并发症发生。TLLC组手术时间10～21min,平均(16.3±2.8)min,明显短于TULC组的32～52min[平均(43.4±2.8)min],差异有统计学意义(P<0.001);TLLC组术后第1天VAS评分[(2.4±0.7)分]显著低于TULC组[(4.5±0.9)分](P<0.001);两组术后切口满意度及术后住院时间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:TLLC是美容效果与TULC相当的新型隐瘢痕术式,与TULC相比,具有手术难度小和术后疼痛轻等优点。

清道夫受体A基因敲除对小鼠肝脏代谢及胆囊结石形成的影响

目的探讨清道夫受体A(scavenger receptor class A,SRA)基因敲除对小鼠肝脏代谢及胆囊结石形成的影响。方法 SRAKO小鼠以及C57BL/6野生型小鼠分别给予成石饲料(lithogenic diet,LD)和普通饲料(Chow)喂养8周后,观察胆囊成石情况,并采集肝脏和胆囊组织。采用免疫荧光染色法测定小鼠肝脏巨噬细胞标记F4/80的表达,Western印迹法测定小鼠肝脏SRA表达,QT-PCR法检测肝脏脂质代谢相关基因及炎症因子的表达,胆固醇试剂盒测定胆囊和肝脏组织胆固醇含量。结果 LD喂养8周后,SRAKO小鼠和C57BL/6野生型小鼠成石率均为100%,而普通饲料喂养均不成石;LD喂养的小鼠肝脏脂质沉积增加,炎性细胞和巨噬细胞浸润增加;LD喂养的C57BL/6野生型小鼠肝脏SRA蛋白表达较普通饲料增高,胆固醇代谢相关基因ABCG5、ABCG8和炎症因子IL-1、TNF-α表达增加(P<0.05)。LD喂养的SRAKO组小鼠胆固醇代谢基因ABCG8、胆汁酸磷脂基因ABCB4和炎症因子TNF-α表达均增加(P<0.05);LD喂养的小鼠胆囊组织中胆固醇酯和游离胆固醇含量均较普通饲料增加(P<0.05)。结论敲除SRA基因不改变小鼠胆囊结石形成率,高胆固醇可能更易导致胆囊结石的形成。

精准医疗背景下基因和基因组学对外科疾病治疗决策的影响

精准医疗是指以个人基因组学信息为基础,结合蛋白质组学、代谢组学等相关内环境信息,为病人量身设计出最佳治疗方案,以期达到治疗效果最大化而副作用最小化的一门定制医疗模式。因此精准医疗比传统医疗具有针对性、高效性及预防性等特征,将开启医疗新时代。为此,2015年奥巴马总统在国情咨文中宣布了预算为2.15亿美元的精准医学计划（precision medicine initiative）。精准医疗计划的实施得益于近年来基因组学、蛋白质组学和代谢组学等检测技术的成熟和成本的下降。2007年二代基因测序技术使测序成本有了大幅降低,从而基因测序得到了广泛的应用。Illumina 公司自2007年每个基因组的测序成本费用已从2007年的1000万美元降到了目前的1000美元。

胆囊结石与胆囊黏膜细胞IL-1β成熟分泌的相关性研究

目的探讨胆囊结石与胆囊组织IL-1β表达及其成熟分泌的相关性。方法收集胆结石胆囊及其胆汁样本21例,其中胆固醇结石4例、色素结石7例、混合结石10例,采用PCR检测细菌感染情况,ELISA检测胆汁中IL-1β,蛋白印迹杂交方法检测IL-1β蛋白表达,免疫组化检测胆囊黏膜IL-1β表达,并分析临床相关性。结果在排除伴有细菌感染的情况下,结石患者胆汁IL-1β含量在1.93-11.80 ng/ml,混合结石组胆汁IL-1β（4.753±2.651）显著高于胆固醇结石组（2.640±0.167）和色素结石组（2.762±1.081）（P〈0.05）;免疫组化、蛋白印迹杂交检测表明胆囊黏膜proIL-1β、IL-1β高表达,推测是胆汁IL-1β重要来源之一、并示胆结石患者胆囊黏膜有炎症小体激活。结论胆结石患者在非细菌感染情况下,胆汁IL-1β增加可能与胆囊黏膜细胞炎症小体的激活密切相关。

血浆L-瓜氨酸和L-精氨酸浓度分析方法建立及应用

目的建立反相高效液相色谱（RP—HPLC）-紫外检测法同时测定血浆卜瓜氨酸和L，精氨酸浓度的方法并应用于临床。方法采用三氯乙酸结合加热法除血浆蛋白，用异硫氰酸苯酯（PITC）进行柱前衍生化反应，梯度洗脱，柱温46℃，波长254nm，进样20μl，流速1．0ml／min；通过分析21例消化道晚期恶性肿瘤病人、21例非恶性肿瘤病人和39例健康人的空腹血浆L-瓜氨酸和L-精氨酸浓度，验证方法的可行性。结果两种氨基酸的峰面积和浓度之间呈线性关系，线性范围从0～1000μmol／L，两者r=0．99995。L-瓜氨酸和L-精氨酸的定量下限分别为0．240μmol／L和0．448μmol／L。日内和日间变异系数（CVS）分别小于3．4％和7．2％，平均回收率在95．2％～104．1％。血浆L-瓜氨酸／L-精氨酸的比值均值，消化系统肿瘤病人组高于年龄性别相匹配的健康对照组，差异有统计学意义（t检验，P=0．009）；两种氨基酸比值诊断消化系统恶性肿瘤的敏感度和特异度分别为81％和71．4％。结论这一新方法可用于临床测定血浆L-瓜氨酸／和L-精氨酸浓度；与浓度相比，血浆两种氨基酸浓度比值也许是评估消化系统恶性肿瘤更加敏感的指标。

线粒体钾通道Kcna3基因敲除小鼠初步制备

目的为观察线粒体钾通道在缺血再灌注(I/R)心肌损伤中的作用,探讨其和心衰的关系,制备基因敲除小鼠模型以探讨钾通道单分子作用。方法用BAC载体制备同源重组载体,对129小鼠胚胎干细胞(ES)打靶筛选后,显微注射至C57BL/6J小鼠囊胚获得嵌合小鼠。经尾基因组DNA PCR鉴定和测序,鉴别杂合子小鼠。结果在40只灰色小鼠中初步鉴定出Kcna3+/-基因型F1小鼠8只。结论在国内首先用ES同源重组基因打靶方法,成功育成Kcna3基因敲除鼠杂合子,为下一步获得纯合子鼠奠定了基础。对进一步用钾离子通道病模型研究心肌保护病理生理机制和药物筛选具重要意义。

泡沫细胞形成与胆固醇结石及胆囊息肉形成的相关性研究

目的探讨胆囊组织中泡沫细胞形成与胆固醇结石和胆囊息肉发生的相关性。方法收集胆囊样本58例,其中胆囊胆固醇结石34例、胆囊胆固醇息肉16例及对照组8例,制作石蜡切片,经HE染色及免疫组化方法检测胆囊黏膜下层泡沫细胞形成及CD14表达情况,分析与临床表现的相关性。结果胆囊黏膜皱褶在胆囊结石组和胆囊息肉组中明显增多,其黏膜下层泡沫细胞检出率分别为50.0%和62.5%,均显著高出对照组12.5%(P<0.05),同时免疫组化结果显示这些泡沫细胞高表达CD14,提示这些泡沫细胞来源与巨噬细胞密切相关。结论胆囊黏膜层内泡沫细胞形成和脂质在黏膜内沉积与胆囊胆固醇结石和胆囊胆固醇息肉发病密切相关。

心肌乙酰胆碱敏感钾通道基因敲除小鼠模型的建立

目的建立Kcnj5基因敲除小鼠模型,构建病理生理或药理实验平台,以确定钾通道和东莨菪碱等药物和心衰治疗的关系。方法用细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)载体构建了Kcnj5打靶载体,电穿孔到129/S6/SvEv品系雄性小鼠的胚胎干细胞SCR012后,用300μg/ml G418、2μmol/L GanC筛选克隆8 d。打靶后的干细胞显微注射到囊胚后,生育嵌合体再交配繁育杂合子及纯合子。用PCR方法结合片段克隆后基因测序鉴定基因型。免疫组化法证实基因型的表达。结果挑取抗性克隆96个中正确同源克隆数20个,阳性率为20.8%。显微注射C57BL/6J囊胚180枚,14只受体出生12只小鼠中得到4只大于50%嵌合率雄鼠。配育获得29只Kir3.4^(+/-)F1代杂合子。现繁育F4后代获得Kir 3.4^(-/-)纯合子约百只。用单抗对敲除鼠心进行免疫组化鉴定,提示纯合子敲除鼠心为阴性。结论用同源重组法敲除了干细胞靶基因,成功建立Kir 3.4^(-/-)建立鼠系。成功建立Kir 3.4钾通道分子病动物模型。该基因的完全缺如模型有利于隔离了该基因的作用,对与之相关的基因的进一步阻断、拮抗或激活等药物研究,也是一个很好的模型。

抗体寡链核苷酸耦联策略在肿瘤相关巨噬细胞极化调控中的应用研究

肿瘤的发生与发展是肿瘤细胞与其肿瘤微环境(TME)相互作用的结果,TME分布着多种基质细胞,其中以肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)最为丰富.根据巨噬细胞与其发生应答反应的辅助性T细胞类型,可大致将极化的巨噬细胞分为M1型和M2型巨噬细胞.在多数肿瘤中,M1型巨噬细胞参与抗肿瘤免疫,而M2型巨噬细胞主要发挥促肿瘤作用并与患者的不良预后相关.最近的研究表明,在肿瘤发展过程中,TAMs经历了从免疫刺激的M1样表型到免疫抑制的M2样表型的过程,该过程受多种因素影响并且可被逆转.这为肿瘤的免疫治疗提供了一种新思路,即通过TAMs的定向调控,逆转M2样巨噬细胞促肿瘤的微环境,发挥M1样巨噬细胞对肿瘤的抑制作用.该方案还有望与免疫检查点阻断(ICB)联用,增强ICB的治疗效果.小干扰RNA(siRNA)介导的基因沉默是一种安全可用于人类的基因调控方式,对TAMs的调控有得天独厚的优势;特异性抗体因其高选择性已被广泛应用于多种肿瘤的靶向治疗.抗体-寡核苷酸结合物(AOCs)正是结合了两者的优势,是实现TAMs中M2样巨噬细胞逆转的最佳方式.本文主要就TME中TAMs的作用及其调节机制进行综述,并探讨应用AOCs对TAMs表型进行定向调控,抑制肿瘤发展的可行性和应用前景.

流式细胞术在精子质量检测中的应用

目的研究流式细胞检测方法在精子质量评价中的应用。方法将104例男性不育患者的精子标记相应的荧光染料,用流式细胞仪检测精子的质膜完整性、染色质状态、顶体状态和线粒体膜电位等,并与精液常规检测方法进行比较和相关性分析。结果男性不育患者精子质膜完整率为(54.20±21.23)%,染色质结构分析t(37.78±22.78)%,SDt(44.24±14.58)%,COMPt(26.24±21.42)%,线粒体膜电位正常率(50.22±18.36)%,活精子的顶体率(25.27±12.08)%,相关性分析结果表明精子的线粒体膜电位与其活动率(a+b)%存在正相关性(P=0.0002)。结论流式细胞术与常规检测方法相比,不仅具有快速、精确的优点,还可以了解精子的内部结构和功能,是评价精子质量的有效方法。

单孔腹腔镜与常规腹腔镜胆囊切除术后切口的比较研究

目的对比单孔腹腔镜胆囊切除术（SILC）与常规腹腔镜胆囊切除术（CLC）术后切口的情况。方法 2011年1~6月,对40例施行SILC（SILC组）和同期配对施行CLC（CLC组）的患者,分别于术后第2天和术后1个月门诊随访时检查切口情况,并填写问卷。结果术后第2天和术后1个月随访时,两组患者切口疼痛程度相近,差异无统计学意义（P〉0.05）。术后第2天切口明显程度、满意程度SILC组优于CLC组（P〈0.05）。术后1个月随访时,SILC组仍高于CLC组,但差异无统计学意义（P〉0.05）。术后1个月随访时,两组患者切口满意程度均较术后第2天升高,但仅CLC组升高有统计学意义（P〈0.05）。结论单孔腹腔镜手术较常规腹腔镜手术具有瘢痕隐蔽及由此引起的切口满意度高的优势,但这些优势随时间推移而消失。就术后切口疼痛程度而言,SILC并无优势。

采用TriPort单孔腹腔镜胆囊切除术的临床研究

目的探讨采用TriPort（Olympus surgery）单孔腹腔镜胆囊切除术（LESC）的有效性和安全性。方法 2009年9月至2011年4月80例良性胆囊疾病患者随机接受LESC（LESC组,40例）和常规腹腔镜胆囊切除术（LC组,40例）,手术由同一位医师完成。比较两组的手术时间、并发症、手术效果和美容效果。所有患者术后随访3~4周。结果两组在术中出血量、术后住院时间、术后第2天VAS评分上相比差异无统计学意义。LC组的手术时间为（15.1±5.9）min,短于LESC组（30.5±11.0）min,差异具有统计学意义（t=0.485,P=0.071）。LC组术后第1天VAS评分为（2.9±1.4）分,低于LESC组的（4.6±2.0）分,差异有统计学意义（t=4.111,P〈0.001）。但是,两组术后第2天VAS评分相比差异无统计学意义。LESC组美容满意度为（1.0±0.2）分,明显优于LC组的（1.7±0.4）分,差异有统计学意义（t=8.484,P〈0.001）。结论采用TriPort行LESC是一种安全、有效和美容效果好的术式。

Syk在哮喘发病中的作用及其可能的靶向治疗

支气管哮喘（哮喘）很常见，而对其治疗的效果仍不理想。上个世纪随着对该病的分子基础的研究，医学科学家们开始研究哮喘的靶向治疗。现已清楚，蛋白酪氨酸激酶（syk）是哮喘发生发展中非常关键的成分。本文就此集中讨论Syk在哮喘发病机制中各个期中的作用，并探讨Syk特异性干扰RNA治疗哮喘的可能性。

自身免疫性疾病的Fcγ受体的靶向治疗

IgG受体（Fcγ受体，FcγR）是重要的免疫应答调节分子。在人类，有3种白细胞FcγR，FcγRⅠ（CD64）、FcγRⅡ（CD32）及FcγRⅢ（CD16）。FcγRⅡ具有两种功能不同的亚型，FcγRⅡA和FcγRⅡB。这两种亚型广泛分布于各种自细胞，是涉及自身免疫性疾病发病的主要受体。在临床和实验研究中已经发现FcγRⅡA的过度激活和／或FcγRⅡB的过度抑制均可导致免疫复合物介导的自身免疫性疾病。因此，下凋FcγRⅡA或上调FcγRⅡB功能也许是治疗自身免疫性疾病的一种有效的方法。

骨髓来源的抑制性细胞的研究进展

很多成功用于实验动物中的肿瘤免疫疗法已经用于临床试验，但是只有部分取得了一定的临床疗效，很多都没有明显的效果。最近，研究者发现在肿瘤病人中有一种骨髓来源的抑制性细胞（MDSC）明显增加。其可以在很多方面抑制免疫系统。研究者正在研究各种克服MDSC的方法，这样可以使得抗肿瘤疫苗和其他的免疫疗法得到更好的效果。