核酸酶NucB高效表达工程菌株的构建及功能测定

目的构建可以高效稳定表达核酸酶NucB的工程菌株。方法以大肠杆菌DH5α(DE3)为材料,采用基因编辑的方法将其中的必需基因lexA敲除,重新设计一个带有lexA基因的质粒进行基因回补,从而得到工程菌株DH5α(DE3)ΔlexA,再将带有目的基因nucB的质粒转入基因改造后的菌株中发酵培养生产核酸酶NucB并测定功能。结果经过基因改造后的大肠杆菌DH5α(DE3)ΔlexA与未经基因改造的大肠杆菌对比显示:改造后的菌株质粒非常稳定,蛋白表达量高且发酵过程中可以不用添加抗生素来生产核酸酶NucB。结论以基因编辑的方法成功构建一株无抗生素、高效稳定表达核酸酶NucB的工程菌株DH5α(DE3)ΔlexA。

适冷菌Pseudomonas extremaustralis PF中海藻糖的合成途径及TreS基因的克隆

通过对一株高寒冰缘植物内生适冷假单胞菌Pseudomonas extremaustralis PF的研究,发现该菌中同时存在TPS/TPP,TreY/TreZ和TreS三种海藻糖合成途径,其中TreS途径的合成酶活性最高.对该菌的海藻糖合成酶TreS的基因进行克隆,得到一个新的TreS基因PFTreS,该基因与已报道的细菌TreS基因在核酸序列上表现出较高的同源性(最高达80.2%).根据基因序列预测的PFTreS氨基酸序列具有TreS酶的催化功能保守区,与假单胞菌P.Fluorescens Pf-5的TreS有很高的同源性.这些结果表明了Pseudomonas extremaustralis中海藻糖的合成特性,为进一步揭示海藻糖的合成与Pseudomonas extremaustralis PF的低温响应机制的关系奠定了基础.

鱼类及两栖动物抗菌肽的研究进展

目前,生物界成功分离750种抗菌肽,其中具有抗肿瘤活性的约占13.1%,源于两栖动物和鱼类分别约占13.3%和9.3%。鱼类和两栖动物抗菌肽均属最原始脊椎动物,后天免疫系统极为脆弱,大部分依靠鳃、皮肤和肠道呼吸,主要依靠强大的先天固有免疫系统来避免病原菌侵染,因此分布在不同部位的抗菌肽便成了这类低等生物形成广谱防御第一道防线的重要组成成分。综述了具有广谱抗菌活性和免疫调节能力的moronecidin、epinecidin-1、paradaxin、misgurin这几种分布在杂交条纹鲈鱼、条带石斑鱼、豹鳎鱼和泥鳅的抗菌肽及臭蛙抗菌肽抗菌谱,如moronecidin可杀死所有的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌;epinecidin-1可有效预防石斑鱼感染嗜盐弧菌(Vibrio vulnificus)并杀死神经坏死病毒;paradaxin具有抗肿瘤活性;misgurin杀菌能力极强,臭蛙抗菌肽能杀死白色念珠菌,总结了在毕赤酵母中成功表达的抗菌肽和源于鱼类和两栖动物中具有抗病毒和抗肿瘤活性的抗菌肽,探讨了这几种抗菌肽应用时存在的问题及解决方案,旨在为绿色、有效的抗菌肽药物在各个领域发挥巨大潜力提供理论依据。

青藏高原土壤中链霉菌的分离鉴定及其抗菌活性研究

对从青藏高原采集的土壤样品中的链霉菌进行了分离鉴定,并对其抗菌活性进行了研究.结果表明:11份土样中分离出菌落形态特征明显不同的链霉菌相似菌株151株,对其中43株进行了16S rDNA测序分析,41株菌株与已知链霉菌的相似性在99%以上,确定为链霉菌属(Streptomyces)菌种,而菌株WDL-DM-5和TTH-DM-1与已知链霉菌的序列相似性分别为90.76%和95%.抗菌试验表明,68株链霉菌对革兰氏阳性菌和阴性菌有抗性,其中41株菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都有明显拮抗性,表明青藏高原土壤中存在强拮抗性的链霉菌.

山东滨海盐碱地柽柳林下微生物量变化特征及其影响因素

以山东昌邑国家级海洋生态特别保护区内柽柳林下土壤微生物为研究对象,测定了其微生物量变化.结果表明:研究区细菌、真菌及古菌基因平均拷贝数分别为8.24×106copies·g-1、1.51×104copies·g-1和2.85×104copies·g-1,微生物量碳、氮平均值分别为140.54 mg·kg-1和29.19 mg·kg-1.自密集区经稀疏区到边缘区,随植被盖度的降低,微生物量呈现降低的趋势.相关分析表明,不同植被盖度所造成的有机质输入的差异是造成这种变化规律的主要因素.

河西走廊土壤链霉菌的分离及其抗菌活性实验

从甘肃河西走廊荒漠地区盐碱土壤中分离出143株链霉菌疑似菌株,拮抗试验表明,其中112株菌对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)有拮抗作用;8株对E.coli BTH 101具有拮抗作用;33株对辣椒晚疫病菌(P.capsici)、甘蓝枯萎菌(F.oxysporum sp.conglutinans)及番茄灰霉菌(B.cinerea)有拮抗作用.16SrRNA基因序列分析表明,其中42株菌为链霉菌属菌种.实验表明:河西走廊荒漠土壤中存在着丰富的拮抗链霉菌资源.

乳酸克鲁维酵母超量表达葡萄糖氧化酶的研究

本研究应用具有超量分泌表达能力的乳酸克鲁维酵母(Kl SEL1基因突变型)、游离型载体p KDU7以及整合型表达载体p KLAC1,对具有5个氨基酸点突变的葡萄糖氧化酶(该突变酶的比活是野生型葡萄糖氧化酶的3.24倍)进行分泌表达。最终获得了一株可以超量分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株,其最大产量为70±7 k U/L。这是现今已报道的分泌表达葡萄糖氧化酶能力最高的乳酸克鲁维重组菌株,为食品安全级的葡萄糖氧化酶的生产和应用提供了新途径。

禽类β-防御素的研究进展

禽类β-防御素是一种小的阳离子非糖基化的多肽,仅存于禽类体中,不仅具有广谱的抗菌活性,还在禽类的免疫调节方面扮演着重要的角色。文章讨论了禽类β-防御素的结构、在组织中的分布、进化、抗菌特性和免疫活性,介绍了禽类β-防御素的国内外研究进展。

节杆菌属细菌处理有机物和重金属污染物的研究进展

有机污染物和重金属造成的环境问题日益严峻。节杆菌属细菌具有很强的环境适应性和抗逆性,广泛分布于各种环境特别是土壤和水体中。研究发现该属菌株具有高效降解环境中的有机污染物和吸附重金属的能力,被用于污染水体和土壤等的生物修复研究与应用。该文从节杆菌属降解污染物菌株、降解污染物的种类、降解机理和影响因素的研究等方面,介绍了节杆菌处理污染物的研究进展。

产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母高密度发酵及产物的分离纯化研究

以实验室构建的产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母基因工程菌作为出发菌株,在摇瓶培养的基础上,建立了100 L发酵罐中高密度发酵工艺及产物分离纯化方法。研究了不同培养基、菌体密度、诱导物及其添加方式等对产物的影响。结果表明,用BSM培养基发酵培养至菌体密度达到190 g/L时开始添加乳糖诱导,乳糖添加量为5 kg,补料流加速度为1 L/h,诱导25 h,菌体细胞湿重达280 g/L,发酵液中蛋白产量达27.8 mg/L,抗菌肽PSI效价达到2.36×109U/L。采用多种分离纯化方法对发酵液中抗菌肽PSI进行分离纯化,结果表明,阴离子交换色谱纯化效率最高,纯化后蛋白效价为8.83×109U/L,其次为丙酮沉淀、超滤、硫酸铵分级沉淀,纯化后蛋白效价依次为6.35×109、4.56×109、3.28×109U/L。

6000千瓦汽轮机隔板焊补工艺

铸钢隔板在浇铸过程中,由于铁水流动性差以及零件结构、铸造工艺条件等因素的影响,在铸件某些部位上总是存在着不同程度的缺陷。例如气孔、夹渣、缩松、裂缝等。因此,对铸件毛坯进行焊补,是制造厂的一道相当重要的工序.

苯二氮䓬类药物对认知功能的影响及相关机制

苯二氮䓬类药物是一类具有抗焦虑、镇静催眠、抗惊厥、肌肉松弛和诱导麻醉作用的药物,具有许多不良反应,其中认知功能损害最具争议,目前已被证实短期应用会损害患者的认知功能,而长期应用是否会损害认知功能有待进一步研究。因此,本文从苯二氮䓬类药物概述、认知功能损害、作用机制、影响因素和当前研究的局限性等方面系统综述了长期应用苯二氮䓬类药物对认知功能影响的文献,旨在为苯二氮䓬类药物的长期合理应用提供借鉴。

溶葡球菌酶高效表达与应用

溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)是采用基因克隆技术使溶葡球菌酶基因实现外源表达所产生的蛋白质。它是Zn2+依赖的金属蛋白酶,具有肽链内切酶活性,能专一性地水解葡萄球菌细胞壁Gly五肽桥联,使金黄色葡萄球菌(特别是MRSA)细胞壁破裂,达到溶菌杀菌作用,而不产生耐药性。作为一种抗菌剂,在兽药与临床等领域具有巨大的应用潜力。综述对溶葡球菌酶的来源、作用机制、不同表达系统及前景与展望进行综述。

泥鳅抗菌肽在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性检测

【背景】泥鳅抗菌肽Misgurin是泥鳅非特异性免疫防御系统的重要组成部分,具有广谱和较强的抗菌能力,所以获得大量抗菌肽是很有必要的。【目的】为了实现高效表达泥鳅抗菌肽Misgurin。【方法】将泥鳅抗菌肽的目的基因与p PIC9K表达载体连接,构建重组表达质粒p PIC9K-misgurin,Sal I酶切线性化,再通过电击法将其整合到毕赤酵母SMD1168染色体上。在MD固体培养基挑选阳性克隆子到MD液体培养基中,30°C、200 r/min摇瓶培养96 h,转接到BMMY液体培养基进行诱导表达,每隔24 h加入5%的甲醇。通过比较抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的大小,筛选出活性较高的菌株p PIC9K-misgurin-22。将该菌株在100 L的发酵罐中诱导表达,48 h后进行活性检测。【结果】经Tricine-SDS-PAGE蛋白胶检测和质谱分析鉴定,p PIC9K-misgurin-22菌株诱导表达的活性物质为抗菌肽Misgurin。发酵罐发酵48 h相对于摇瓶发酵48 h,抗大肠杆菌的生物效价提高了1.47倍,抗金黄色葡萄球菌的生物效价提高了1.43倍;抗菌肽Misgurin对鲍曼不动杆菌、沙门氏菌有较弱的抗菌活性,对致病菌产气荚膜梭菌和益生菌如枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、乳酸菌没有抗菌活性,无明显溶血活性;当温度达到90°C时发酵液的抗菌活性明显减弱,调发酵液的p H值在1.0-12.0之间都有抗菌活性;加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K后抗菌活性减弱。【结论】获得了一株在毕赤酵母中表达量较高、有工业化生产潜力的产抗菌肽Misgurin的菌株。

天蚕素AD在毕赤酵母中的多拷贝整合表达及表达条件优化

【背景】天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽,实现工业化生产为其在农业、养殖业中的应用奠定了基础。【目的】获得一株高效生产天蚕素AD的基因工程菌株。【方法】构建重组载体pGAPZαA-CAD通过电击转化至PichiapastorisX33中,表达天蚕素AD基因并获得X33/GCAD菌株;构建重组载体pUCGAP-CAD导入至X33/GCAD菌株中。pGAPZαA-CAD是以博来霉素为抗性筛选标签被整合到P.pastoris X33的GAPDH启动子区域,pUCGAP-CAD是以遗传霉素为抗性筛选标签被整合到P.pastoris X33的非翻译rDNA区域,最终获得一株高效表达天蚕素AD的酵母菌株X33/GUCAD。【结果】通过质谱分析鉴定X33/GUCAD表达的抑菌物质为天蚕素AD,通过发酵条件的优化,表明X33/GUCAD菌株在以甘油为碳源和以蛋白胨、酵母提取物为有机氮源的情况下具有较强表达天蚕素AD的能力。【结论】较高的拷贝数更有利于提高天蚕素AD的产量,此工程菌株在后期发酵过程中稳定性较好,适于工业化生产。

溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究

根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(p KLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K.lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K.lactis GG799/p KLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH_4NO_3可提高酶比活性,最适表达p H为7.0~7.5,最适反应p H为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,p H 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr^(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Ba^(2+)、Ca^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)、Mn^(2+)、Mg^(2+)对其有明显的抑制作用。

小仓鼠的房子

今天早上起床后我就非常开心!因为昨天爸爸答应和我一起打扫我养的小仓鼠的家。小仓鼠的名字叫灰灰，它可爱极了。我们先到楼下的空地上清洗了它住的“房子”，哎呀!它的房子里真臭呀!然后我们在房子里铺上一层新的“地毯”，爸爸说这个东西可以保持很久不臭哦。灰灰走进新房子就好像发了躁，它在房子里跑来跑去，很不安定。我很奇怪，就问爸爸为什么，爸爸说小动物是靠气味找到自己的家的，现在它找不到原来的气味了，但是过了几天就会适应的。