代谢工程改造酿酒酵母高效合成游离脂肪酸

该文以酿酒酵母BY4741作为底盘细胞,通过系统代谢工程改造提高游离脂肪酸(free fatty acid,FFAs)的合成。首先,通过删除酰基CoA合成酶FAA1、FAA4以及FAT1的编码基因,提高FFAs的合成,酵母工程菌株FFAs达到384.4 mg/L。进一步,通过敲除POX 1、FAA 2和PXA 2基因,破坏了酵母细胞的β-氧化途径,使细胞外FFAs进一步提高,达到了394.9 mg/L。随后,通过敲除磷脂酸磷酸酶编码基因DPP 1,LPP 1,PAH 1,降低了磷脂酸(phosphatidic acid,PA)的去磷酸化水平,上调了获得的多基因缺失的酵母工程菌(Δfaa 1Δfaa4Δfat1Δpox1Δfaa2Δpxa2Δdpp1Δlpp1Δpah1)能够产生497.3 mg/L的细胞外游离脂肪酸,以及1332.2 mg/L的总脂肪酸。通过组合代谢工程产生的平台菌株,为未来发展脂质相关的细胞工厂提供了基础。

代谢工程改造热带假丝酵母生产鼠尾草酸

鼠尾草酸(carnosic acid,CA)是一种酚类二萜化合物,广泛存在于鼠尾草等唇科类植物中。CA具有抗肿瘤等多种生理以及药理活性,在日化、食品、医疗领域应用价值巨大。热带假丝酵母具有鲁棒性强、耐高温、产油脂等特性,因而在萜类化合物高效生产方面极具潜力。该研究根据热带假丝酵母密码子偏好性对来源于鼠尾草的铁锈醇合酶基因CYP76AH24和鼠尾草酸合酶基因CYP76AK6、来源于拟南芥的细胞色素还原酶基因ATR1进行全序列密码子优化以及基因合成。以生产鼠尾草酸前体次丹参酮二烯热带假丝酵母1C2PM04作为出发菌株,将上述基因整合到其基因组中成功合成鼠尾草酸。利用模块化工程与酵母不同亚细胞区室的空间组合,将上述3条基因以模块化的方式导入胞质和过氧化物酶体中进行表达,鼠尾草酸产量分别为10.25 mg/L和4.64 mg/L。通过下调角鲨烯合酶基因ERG9,降低法尼基焦磷酸池的消耗进而改变代谢通量进一步提高鼠尾草酸产量,效价达到26.3 mg/L。将细胞色素P450酶和细胞色素还原酶进行融合表达,测试以刚性linker(E3AK,E3AK×2,E3AK×3)和柔性linker(G4S,G4S×2,G4S×3)为连接肽,融合表达CYP76AH24和ATR1,鼠尾草酸产量提高1.54倍。该文通过增加CPR拷贝数,增加电子供体,进一步提高鼠尾草酸表达水平,产量达到78.24 mg/L。

黑曲霉耐热型葡聚糖酶纤维素结合结构域的替换与融合体酶性质

该文旨在通过更换纤维素结合结构域(cellulose binding domain, CBD)的方式探索获得具有纤维素水解能力的耐热型葡聚糖酶的方法。黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡聚糖酶AnEglA6具有优越的耐热性能,在禽类饲料生产中具有应用前景。通过更换不同家族来源的碳水化合物结合结构域(carbohydrate binding module, CBM)编码区,构建了融合体葡聚糖酶基因,分别在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行异源表达。AnEglA6催化结构域与分别来源于嗜热菌(Caldicellulosiruptor kristjanssonii)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的木聚糖酶的底物结合结构域CBM9、CBM10结合获得的融合体酶AnEg-CBM9和AnEg-CBM10均具有较高的纤维素水解能力,并且底物范围进一步扩大,对微晶纤维素也具有一定的水解能力。AnEg-CBM10热稳定性有显著的提高,在85℃下酶活力半衰期达到40 min左右,能短时耐受90℃高温。融合体酶AnEg-CBM10是一种热稳定性提高、具有纤维素水解能力的新型葡聚糖酶。

重组大肠杆菌全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸

N-乙酰神经氨酸具有多种生物学功能,在食品添加剂和药物合成等方面有着重要的应用。为了降低成本,作者利用重组大肠杆菌,并以含有N-乙酰葡萄糖胺的发酵液为底物进行全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸。结果表明,在温度为30℃、转化液初始pH为6.5、底物丙酮酸浓度为1.38 mol/L、Triton X-100添加质量分数为0.4%、菌体OD_(600)为30的条件下在5 L发酵罐等条件下进行全细胞转化,可以得到N-乙酰神经氨酸180 mmol/L,摩尔转化率为65.45%。用阴离子树脂对产物进行初步分离纯化,经高效液相色谱分析证实纯化后产品为高纯度N-乙酰神经氨酸,其纯度为98.3%,结晶回收率为42.5%。作者建立并优化了一种以含有N-乙酰葡萄糖胺的发酵液为底物直接进行全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸的工艺流程,既节约了成本,又具有可持续发展的优势。

黑曲霉高耐热葡聚糖酶的分子截短与制备条件优化

该文旨在通过分子截短的方式提高高耐热葡聚糖酶AnEglA6的表达水平并针对重组菌建立相应的发酵方法。高耐热β-葡聚糖酶在禽类饲料生产中有着重要作用。黑曲霉来源的葡聚糖酶AnEglA6具有优越的耐热性能,适合在禽类饲料中使用。采用C端截短方式对该葡聚糖酶进行分子精简,构建了去除连接桥和纤维素结合结构域的截短体基因eglA6c,分别在乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母中进行异源表达获得重组酶AnEglA6cK和AnEglA6cP。乳酸克鲁维酵母表达的重组酶AnEglA6cK最适温度为75℃,在80℃下酶活力半衰期达55 min,能短时耐受85℃高温,应用性能显著优于AnEglA6cP。针对截短体酶AnEglA6cK在发酵后期酶活力快速下降的问题,对发酵条件进行了优化。通过以大豆蛋白胨替代酪蛋白胨的方式延长产酶时间、大幅度提高了摇瓶发酵水平。

纤维微菌β-1,3-葡聚糖酶的克隆表达及对灵芝细胞壁的水解作用

该文旨在研究一种酶解灵芝(Ganoderma lucidum)菌丝体从而提高其胞内蛋白提取效率的方法。通过PCR方法扩增获得纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)CICIM6906的β-1,3-葡聚糖酶编码基因,该基因命名为bgl6906并与表达载体连接,构建重组质粒pET28a-bgl6906,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-bgl6906。重组菌在TB培养基中进行诱导表达,表达产物在自身信号肽引导下大部分分泌到细胞外。以茯苓多糖为底物时,重组酶BGL6906纯酶比酶活力为567.8 U/mg,最适pH为5.5,最适温度为50℃。重组菌在15 L发酵罐中发酵72 h胞外酶活力达到67 U/mL。重组酶BGL6906与果胶酶交替水解灵芝菌丝体培养物,可以有效水解细胞壁,获得部分原生质体。进一步辅助短时超声波破碎可以大幅度提高灵芝胞内产物的释放。

后基因组时代的丝状真菌基因组学与代谢工程

丝状真菌不仅是传统发酵工业中抗生素、酶制剂和有机酸的主要生产者,而且也是代谢工程育种中异源蛋白表达的重要细胞工厂。丝状真菌的遗传修饰和代谢工程研究是现代工业生物技术领域最具活力的研究方向之一。特别是与细菌和酵母相比,丝状真菌在细胞生长、营养需求、环境适应性、翻译后修饰、蛋白分泌能力和生物安全性等方面具有显著的优势。文章综述了丝状真菌作为异源蛋白表达系统在基因组学技术研究和代谢工程研究方面的最新进展。作者在分析丝状真菌基因组结构、特点的基础上,阐述了比较基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学等对丝状真菌的代谢途径重构、新型蛋白挖掘和代谢工程育种中的作用和意义。另一方面,作者分析了丝状真菌在表达外源蛋白时遇到的瓶颈问题,总结了丝状真菌代谢工程育种中的常用策略包括异源基因的融合表达、反义核酸技术、蛋白分泌途径改造、密码子优化和蛋白酶缺陷宿主的选育等技术和手段。最后,对该领域的发展趋势进行了展望。

产甘油假丝酵母与酿酒酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因的功能比较

胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酿酒酵母细胞甘油合成过程中的关键限速酶.尽管高产甘油菌株产甘油假丝酵母基因组中编码该酶的基因CgGPD已经被克隆出来,但是具体的功能,特别是与酿酒酵母GPD1和GPD2基因的功能比较值得进一步研究.以酿酒酵母渗透压敏感型的gpd1/gpd2和gpd1突变株为宿主,分别导入CgGPD、GPD1和GPD2基因,比较分析了CgGPD、GPD1和GPD2基因在高渗透压胁迫条件下和厌氧环境中的表达调控,及其对细胞甘油合成能力的影响.研究发现,GPD1基因受到渗透压诱导表达,GPD2基因在细胞厌氧条件下起着氧化还原平衡调节作用,而CgGPD基因不仅能够在渗透压胁迫条件下通过过量快速合成甘油调节渗透压平衡,而且能够在厌氧培养环境中互补GPD2基因的缺失,使gpd1/gpd2缺失突变株能够正常生长,同时提高了突变株的甘油合成能力.结果表明,CgGPD基因在gpd1/gpd2缺失突变株中既具有GPD1基因的功能,又能发挥GPD2基因的功能.

产甘油假丝酵母甘油合成关键酶编码基因的克隆

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)作为优良的甘油生产菌株已经成功应用于工业化生产。但相对于酿酒酵母,该菌株的耐高渗机理和甘油代谢的分子机制还不甚清楚。本文根据已公布的3-磷酸甘油脱氢酶基因的序列信息,设计出一组寡核苷酸,再运用简并PCR结合反向PCR技术从C.glycerinogenes的基因组DNA中获得了4900 bp的核苷酸序列,递交GenBank(No.EU186536)。该序列包含完整的编码胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因(CgGPD)开放阅读框及其上、下游调控序列。1167bp的开放阅读框编码388个氨基酸残基的蛋白。所演绎出氨基酸序列分析比对结果表明该基因产物的序列具有典型的胞浆3-磷酸甘油脱氢酶结构特征,但与已鉴定的相关基因存在中等程度的同源性并在相应的辅酶催化位点和底物结合位点区域具有高度的保守性,在氨基酸水平上与安格斯毕赤酵母的相似性最高,达到70.9%。该基因在Saccharomy cescerevisiae W303A中异源表达能够显著提高细胞的甘油合成能力。

纳米加工中的光驻波场研究

介绍了纳米加工中的光驻波场 ,分别对单反射面和双反射面形成的驻波进行了分析 ,并对不同区域的光强分布进行了理论推导。最后对如何形成高质量的光驻波场进行了探讨。

以Zeocin抗性基因为选择标记的Candida glycerinogenes遗传转化

为从分子水平上阐释产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)高产甘油机理,建立一种方便可行的遗传转化系统是十分必要的。与G418和潮霉素等抗生素相比,Zeocin抗生素对C.glycerinogenes具有较低的致死浓度。以pGAPZb作为构建整合载体的骨架,以Zeocin抗性基因作为选择标记,以URA3基因作为整合位点,构建了C.glycerinogenes整合载体pGA-CU。整合载体经过限制酶线性化后用作转化载体,基于电击转化的方法成功获得了抗Zeocin的转化子并经过PCR分析进一步确证。通过优化电击转化的参数,获得了较为稳定的转化效率,基于这一技术的转化效率每微克DNA可获得120个转化子。为进一步研究该菌株的遗传背景和代谢机理奠定了基础。

技术本科院校软件工程专业人才培养模式创新探讨与实践——以上海电机学院创新实验班为例

技术本科创新人才培养是为了培养能够适应企业需求、具有较强专业能力等综合素养的人才。上海电机学院软件工程专业通过设立"创新实验班",强化专业设置、课程体系、教学方式、实践环节等核心要素,提出培养计划应注重专业能力,培养过程应强化学生学习能力、研究能力、实践能力、国际化能力等,同时完善培养模式评价机制,以提升人才培养质量。

亚稳态氦原子束在纳米结构制作中的应用

介绍两种用亚稳态氦原子束制作纳米结构的新方法。亚稳态原子束从原子源喷出后首先对其进行横向激光冷却,准直后的原子束穿过与之垂直的激光驻波场时发生淬火过程,原子的密度分布出现沟道化效应,给出基于光掩模制作纳米图形的基本原理、理论分析及模拟结果。介绍基于物理掩模制作纳米图形的原理和SAM抗蚀剂,利用沉积在基底上的亚稳态原子破坏基底上的SAM膜,结合刻蚀技术可制作出纳米量级的图形。

应用于人脸识别的结合SVD变换的图像类特征提取算法

由于矩阵奇异值(SVD)为依据的图像识别技术中,SVD与矩阵之间不是一一对应的。为此提出了同类图像的类SVD变换及其图像特征提取方法。并采用最近邻法进行分类识别,应用于人脸识别中,有较好的效果。

原子束在光定波场中的聚焦研究

建立了描述原子束在光定波场中聚焦行为的理论模型并通过数值计算给出原子在光驻波场中的运动轨迹 。

技术本科计算机专业实践教学体系构建

实践教学是培养应用型人才的一个重要环节,是技术本科教育内涵发展的重要途径。通过基础课程实验、综合设计实践、应用能力实践,促使学生将理论学习与实践学习相结合、课内学习与课外学习相结合、自主学习与集中学习相结合,既学会独立思考、善于交流合作,又学会深入分析问题、解决问题。

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因(CgGPD)功能分析

【目的】从高产甘油生产菌株产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)基因组中克隆了NAD^+依赖3-磷酸甘油脱氢酶编码基因(CgGPD),但是该基因及其上游调控序列具体的功能还是未知的。本文研究了CgGPD基因及其上游调控序列的功能。【方法】本文以酿酒酵母(Saccharomyces cere- visiae)及其渗透压敏感型突变株为宿主,构建3种不同的酵母表达载体导人酵母细胞,研究了不同酵母转化子在渗透压胁迫条件下CgGPD基因表达对细胞的耐高渗透压胁迫应答及其细胞的甘油合成能力的影响。【结果】实验结果表明无论是以来源于S.cerevisiae的TPI启动子还是来源于CgGPD基因的启动子,过量表达CgGPD基因的转化子均能够显著加速葡萄糖消耗速度和提高甘油合成能力,在gpd1/gpd2突变株中表达CgGPD基因能够消除细胞对外界高渗透压的敏感性,同时转化子胞内甘油大量积累。【结论】CgGPD基因在野生型酵母S.cerevisiae W303-1A表达显著提高细胞的甘油合成能力,在gpd/1gpd2突变株中能够互补GPD1基因的功能,CgGPD基因表达受渗透压诱导调控。

原子光刻用超高真空蒸发设备的设计和建立

原子光刻是原子光学在微细加工技术领域的新应用.在对各种材料和真空泵性能综合考虑的基础上,设计并建立了一台用于原子光刻的超高真空蒸发设备.主要设计参数为:极限真空度和工作真空度分别为2.0×10-6 Pa 和1.0×10-5 Pa,原子源温度在300～1850℃范围内连续可调.初步运行结果表明极限真空度优于设计参数,温度连续可调.

基于学科交叉融合的微生物学实验教学改革探索

微生物学作为实践性较强的一门学科,是生物工程专业和生物技术专业最重要的基础课程之一。微生物实验教学具有与理论教学同样甚至更重要的地位。江南大学生物工程学院在总结多年教学实践的基础上,对微生物实验教学进行了系列改革探索。基于多学科交叉融合的知识体系和递进提高式教学理念,将实验课程分为单元操作实验、综合型实验、设计型实验和创新型实验。同时,对课程考核模式也做了相应的改革。实践表明,教学改革使得课程设置更科学合理,学生学习兴趣极大提高,教学效果显著提升。

ICU呼吸机相关性肺炎的病原菌分布及耐药性分析

目的分析本地区ICU呼吸机相关性肺炎(VAP)的病原菌分布及耐药性特点,更好的指导临床抗菌药物的应用。方法回顾性分析ICU收治的机械通气>48h的573例患者的资料,对下呼吸道分泌物进行细菌培养、分离和鉴定,药敏试验采用K-B纸片扩散法。结果 573例患者中发生VAP 118例,VAP发生率为20.59%。118例患者中共分离出125株病原菌,包括革兰阴性菌97株,占77.6%,革兰阳性菌23株,占18.4%,真菌5株,占4.0%。分布最多的三种细菌为铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌,分别占22.4%、20.0%和15.2%。常见革兰阴性菌铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌表现出多重耐药性。结论本地区ICU发生的VAP以革兰阴性菌感染为主,致病菌主要为铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌,呈现出多重耐药性,临床在经验性治疗过程中,可根据药敏结果进行选择合理的抗菌药物。