医疗机构细胞产品制备中心现状和发展策略

我国细胞治疗产品主要依托医疗机构或标准化制备机构进行生产,与标准化制备机构相比,医疗机构细胞制备中心具有样本来源丰富、治疗方案灵活、距离和时效等优势,但同时也存在产量小、洁净车间建设管理经验不足、经费支撑有限等问题。基于现状,该文提出多模式协作、GMP专业辅助、提高科研成果转化率等发展策略,随着生产设备/材料国产化、成果转化等利好政策落地,医疗机构细胞产品制备中心将成为临床前瞻性、探索性研究及细胞产品制备的重要依托,丰富重大及难治性疾病的治疗方法。

大鼠胰腺导管上皮细胞中白介素-1受体相关激酶-M的表达及意义

目的探讨白介素-1受体相关激酶-M(IRAK-M)在胰腺导管上皮细胞(PDEC)中的表达状况及其在急性胰腺炎发病过程中的临床意义。方法脂多糖(LPS)刺激原代培养大鼠胰腺导管上皮细胞,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,分别检测第2、6、12、24h刺激组和对照组I-RAK-M,Toll样受体-4(TLR-4)及下游炎性细胞因子的mRNA表达量。结果IRAK-M mRNA在胰腺导管上皮细胞中呈阳性表达,与对照组相比,呈现出先降低后明显升高的趋势,于12h时达到峰值;与此相反,TLR4在刺激发生前期迅速上调,12～24h回落至基线水平。结论在LPS诱导的胰腺导管上皮细胞中,IRAK-M的表达具有一定的滞后性。IRAK-M可能通过调控TLR信号通路参与急性胰腺炎的发病过程。

应用联合酶建立BALB／c鼠枯否氏细胞体外分离培养方法

目的用作用功效不同的酶联合消化分离BALB／c鼠枯否氏细胞（KC），建立简便易行，产量、活性、纯度较稳定的KC分离培养方法。方法将0．1％Ⅳ型胶原酶、0．2％链霉蛋白酶、0．01％Dnase Ⅰ酶按1：1：1比例混合原位灌注和离体消化肝组织，经Percoll梯度离心，贴壁培养纯化细胞，应用荧光显微镜观察、免疫组织化学染色、吞噬功能实验进行鉴定。结果KC获得率为（2～3）×10^6／鼠肝，细胞存活率达96％，免疫组化和吞噬实验鉴定细胞纯度达92％。KC贴壁后形态大小不规则，呈多角形或星形，免疫组织化学染色显示溶菌酶阳性，胞浆内见吞噬的碳素墨汁颗粒。结论用作用功效不同的酶联合消化KC，经梯度离心和贴壁培养，可获得高产量、高活性、高纯度的BALB／c鼠KC，为进一步研究KC在肝脏疾病中的作用提供可靠的细胞来源。

AEP大鼠外周血淋巴细胞的分离及其影响因素的探讨

目的 研究分离急性水肿型胰腺炎（AEP）大鼠外周血淋巴细胞的方法和技巧。方法 采用皮下注射蛙皮素缩胆囊肽（caenllein）的方法诱发AEP大鼠模型，以1％EDTA处理过的采血空针和离心管采集和储存血液，PBS液稀释血样，离心机转速2500r／min，18-20℃离心30min，收集淋巴细胞。结果 通过上述改良方法，能提高淋巴细胞的纯度、获得率和细胞活力，满足实验要求。结论 我们探索出成熟而有效的提取大鼠外周血淋巴细胞的试验步骤和技巧。为各项基础和临床研究奠定较为坚实的试验基础。

PPAR-β基因对人结肠癌细胞裸鼠成瘤的影响及机制研究

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-β (peroxisome proliferator-activated receptor-β, PPAR-β)对人结肠癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响及机制。方法:分别将PPAR-β特异性沉默和野生型的人结肠癌细胞KM12C种植于裸鼠背部皮下,动态监测移植瘤体积,20天后取瘤体称重,免疫组化比较二者分化程度;荧光定量PCR(RT- PCR)、免疫组化、Western blot检测体内外人结肠癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达;此外,用PPAR-β特异性激动剂GW501516处理离体细胞,检测VEGF与剂量的相关性。结果:PPAR-β沉默组的移植瘤生长速度明显快于对照组,并且低分化肿瘤的比例、VEGF表达水平显著高于对照组。特异性激活沉默组的PPAR-β并没有改变其VEGF的表达,在对照组中则观察到VEGF水平与激活程度呈剂量相关性降低。结论:PPAR-β沉默在移植瘤中发挥了促瘤作用,提示PPAR-β可能是结肠癌细胞的抑癌基因,并可伴有阻止VEGF表达的作用。

高成本驱动下的CAR-T工艺发展趋势

近年来随着科学技术的飞速发展,嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor-T cell,CAR-T)产品从分子设计到制备技术均取得了突破性进展,疾病治疗范围从血液系统肿瘤逐步扩大至自身免疫性疾病及实体瘤。然而,生产成本高、产能低是目前CAR-T产品面临的最大现实问题,严重限制了其临床可及性。原辅料价格高昂、定制化生产导致的质检费用和公用设施设备投入无法摊薄、技术依赖下的高人力成本均是CAR-T产品成本居高不下的重要原因。对目前造成CAR-T产品高成本的具体因素及针对性解决方案进行分析,总结发展趋势,以期为CAR-T制备技术的降本增效提供一些参考和建议。基因转导工艺改良,特别是非病毒转导系统的开发、通用型细胞治疗产品的探究、国产自动化设备的布局,是未来CAR-T技术发展的重要方向。随着科研人员的持续攻坚,CAR-T产品成本下降将成为必然趋势,最终成为普通患者可及的“平民化”治疗药物,为重病患者提供更多治疗机会。

一种急性胰腺炎腺泡细胞凋亡/坏死体外模型的改良

目的首次将共培养体系及混合腹水技术应用于急性胰腺炎腺泡细胞凋亡/坏死体外模型,并与常见的雨蛙素及雨蛙素联合脂多糖(LPS)模型进行对比研究,以观察其改良效果。方法体外培养的大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J分为4组:对照组(培养液+PBS),雨蛙素组(培养液+10nmol/L雨蛙素),雨蛙素+LPS组(培养液+10nmol/L雨蛙素+10mg/L LPS)及改良腹水组。改良腹水组采用牛黄胆酸钠诱导的重症急性胰腺炎动物模型腹水,混合后加入共培养体系,刺激体外培养的同源腺泡细胞造模。共培养体系的设置为:培养板中置入孔径为1μm的小室,以体积比1∶1于孔板和小室中分别加入培养液及混合腹水。各组刺激24h后收集腺泡细胞,采用流式细胞术检测腺泡细胞的凋亡/坏死率,Western blot检测凋亡/坏死相关蛋白B淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、受体相互作用蛋白1(RIP1)的表达情况,透射电镜观察腺泡细胞的亚显微结构。结果改良腹水模型中腺泡细胞以坏死特征为主,与其余3组相比,其凋亡率及坏死率均上调,RIP1及BAX蛋白表达水平上调,而Bcl-2蛋白呈下调趋势。透射电镜结果显示改良腹水组腺泡细胞细胞器结构破坏,细胞膜降解。而雨蛙素及雨蛙素+LPS模型与对照组相比,腺泡细胞凋亡率上调,坏死率无改变;促凋亡蛋白Bax表达升高,而RIP1蛋白的表达水平无显著上调。透射电镜结果显示雨蛙素及雨蛙素+LPS组细胞染色质固缩成团,胞质降解,细胞膜完整,呈现出典型的凋亡特征。结论相较于以腺泡细胞凋亡特征为主、研究轻症急性胰腺炎的雨蛙素及雨蛙素+LPS模型,改良的腹水模型以腺泡细胞的坏死特征为主,是研究腺泡细胞坏死及重症急性胰腺炎的良好模型。

人结直肠癌细胞株研究及使用现状

结直肠癌细胞株是研究结直肠肿瘤癌变、浸润转移机制、探寻新的治疗药物及策略的理想模型。然而，目前存在结直肠癌细胞株数目众多、质量参差不齐以及研究者对其生物学特性重视不足等众多问题，导致结直肠癌研究中对细胞株的选择及使用不规范，影响实验结果的准确性，甚至可能得出错误结论。本文对迄今已建立的人结直肠癌细胞株进行整理分类，从其建立和应用、分类与选择、使用现状与存在问题3方面进行总结。

重症急性胰腺炎免疫调节治疗的研究进展

重症急性胰腺炎（SAP）病程复杂,预后凶险.免疫应答失衡是导致胰腺炎患者转向重症甚至死亡的重要原因.免疫调节治疗可调控机体失衡的炎症反应,减轻SAP相关器官损伤,改善患者预后.早期免疫调节措施存在对象单一、方式简单等问题.近年来新出现的治疗方式,如调节免疫细胞成熟与凋亡、应用间充质干细胞（MSCs）及多因素联合治疗等,为未来SAP的治疗提供了新的思路和希望.本文就SAP免疫调节的发展及近年来的新进展进行综述.

肠隐窝上皮细胞Myd88稳定沉默体外模型的建立及早期凋亡研究

肠道炎症性疾病临床常见,发病率逐年上升而病因不清。现已证实Toll样受体4(TLR4)信号通路与肠道炎性疾病密切相关。髓样分化蛋白88(Myd88)是TLR4炎症信号通路上游关键调控点,对肠道炎性疾病的研究具有重要价值,但目前尚缺乏Myd88稳定调控表达的体外模型。本实验利用慢病毒三质粒包装系统,构建特异靶向Myd88基因RNA干扰(RNAi)病毒载体。采用改良病毒离心法结合离心孵育法(MVC-S)行肠隐窝上皮细胞(IEC-6)转导,采用Real-time PCR及Western blot检测Myd88mRNA及蛋白水平,Annexin V染色、流式细胞术检测Myd88沉默后对IEC-6细胞早期凋亡影响。结果显示正确构建的慢病毒shRNA载体,可通过改良MVC-S法成功转导IEC-6细胞,转导后的IEC-6细胞Myd88表达明显下调,同时早期凋亡减少。本实验成功构建了慢病毒载体介导的RNAi的Myd88稳定沉默细胞系,并总结分享了实验中的关键技术条件及要点,同时描述了沉默Myd88后IEC-6细胞早期凋亡明显减少的特征,为肠道炎性疾病的发病机制及靶向治疗研究提供了一个新的、稳定的、可重复的细胞模型。

低位直肠癌直肠系膜、盆腔侧方淋巴结转移规律分析

目的研究低位直肠癌直肠系膜、盆腔侧方淋巴结转移和微转移规律。方法联合运用大组织切片与组织芯片技术,研究67例全直肠系膜切除（total mesorectal excision,TME）、盆腔侧方淋巴结清扫手术标本。结果直肠系膜淋巴结癌转移30例,微转移10例,29.6%转移淋巴结位于直肠系膜外带。肿瘤远端、肿瘤旁和肿瘤近端直肠系膜内淋巴结转移的检出例数分别为4、32和19例,与肿瘤分化程度相关。9例标本存在环周切缘癌浸润（circumferential resection margin involvement,CRMI）,2例见微转移。盆腔侧方淋巴结癌转移、微转移分别为12例和10例,与肿瘤分化程度、浸润深度相关。结论按照TME原则手术,完整切除包裹在盆腔筋膜内的直肠系膜,可提高局部肿瘤廓清率,降低CRMI发生率。低位直肠癌盆腔侧方淋巴结转移较常见,应合理制定手术范围。

稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立

目的设计并构建编码大鼠葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的短发夹样RNA(shRNA)慢病毒载体,用以建立稳定沉默GRP78基因的大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J。方法设计并合成3条编码大鼠GRP78mRNA的shRNA质粒表达载体,用三质粒包装系统包装成慢病毒,并以相应慢病毒转导大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J。经流式细胞分选术(FCAS)筛选出绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞,采用real-time PCR及Western blot方法检测GRP78基因的mRNA和蛋白表达。结果测序证实,成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3。慢病毒转导AR42J细胞后,经荧光显微镜和FCAS证实转导效率>85%。经real-time PCR验证,与未处理组相比,LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3处理组对GRP78mRNA表达的沉默效率分别为69.4%±1.42%、74.7%±1.69%和86.6%±1.73%(P<0.05),含无义序列的阴性质粒LV-Non Target对照组与未处理组相比,GRP78mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示各组GRP78蛋白表达与mRNA表达趋势一致。结论成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体,建立了稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J,为探讨GRP78基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供了新的细胞模型。

糖原合酶激酶3β在轻型/重症急性胰腺炎细胞模型中的表达

目的 探讨糖原合酶激酶3β（GSK3β）在轻型/重症急性胰腺炎发病中的表达及作用方法 采用单独雨蛙素、雨蛙素联合脂多糖刺激分别构建轻型急性胰腺炎（MAP）和重症急性胰腺炎（SAP）的细胞模型,分别在2、4、8、12、24 h收集细胞培养基上清,酶联免疫吸附测定（ELISA）检测淀粉酶、脂肪酶、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的表达变化,流式细胞术检测细胞凋亡率及坏死率,实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测GSK3β及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、-8、-9 mRNA表达变化.结果 雨蛙素组和雨蛙素＋脂多糖组各时间点淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6较对照组均增高,且在大多数时间点,雨蛙素＋脂多糖组组比雨蛙素组水平更高,开始上调时间相同或更早（P＜0.05）.刺激24 h后,雨蛙素组凋亡率[（19.2±0.9）％]显著高于雨蛙素＋脂多糖组[（10.2±0.5）％,P ＜0.05].雨蛙素组坏死率[（5.8±0.3）％]显著低于雨蛙素＋脂多糖组[（13.6±0.7）％,P＜0.05].SAP组的坏死/凋亡比值是MAP组的5倍.GSK3β的mRNA水平在雨蛙素组中是2h短暂下调[相对表达量为（0.5±0.1）倍]后于8h显著上升[相对表达量为（3.0±1.1）倍,P ＜0.05],然后又逐步下降;而在雨蛙素＋脂多糖组中则是是8h才缓慢上调[相对表达量为（1.8±0.6）倍,P＜0.05],至24 h达到高峰[相对表达量为（3.6±0.3）倍,P＜0.05].GSK3β和Caspase-3 mRNA水平均有升高,但差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 采用单独雨蛙素、雨蛙素联合脂多糖刺激分别建立MAP和SAP细胞模型可行;GSK3β在MAP和SAP中可能通过促进腺泡细胞凋亡来起作用.

过氧化物酶体增殖因子活化受体δ基因对人大肠癌细胞凋亡的影响

过氧化物酶体增殖因子活化受体δ（PPAR5）是APC／β-catenin／Tcf-4信号通路上亟待揭示的下游靶基因之一，其下游靶基因的激活可能导致大肠癌的发生。本实验采用流式细胞术及原位缺口末端标记法（TUNEL）观察PPAR8基因沉默对大肠癌细胞凋亡的影响。

Toll样受体4基因突变体过表达慢病毒的构建及鉴定

Toll样受体4（TLR4）基因2287T突变体则是我们在中国人中鉴定发现的一种有义突变，为研究该突变体的功能，我们构建了其过表达慢病毒及稳定表达细胞株。

内皮素1对大肠癌HCT-116细胞增殖的影响

目的探讨内皮素1对大肠癌HCT-116细胞增殖的影响。方法应用RT-PCR及免疫组织化学法检测大肠癌HCT-116细胞内皮素1，内皮素受体A、B表达情况；应用MTT法检测不同浓度和作用时间的内皮素1对体外培养大肠癌HCT-116细胞增殖的影响，多组比较采用方差分析。结果HCT-116细胞存在内皮素l及内皮素受体A、B的基因和蛋白表达；内皮素1能明显促进大肠癌HCT-116细胞的增殖，在干预48h且浓度为1×10^-7mol／L时达到最强。结论内皮素1通过细胞膜上受体的介导，促进HCT-116细胞的增殖，呈药物浓度依赖性。

人胚肾细胞株对脂多糖刺激的反应及关键基因的表达

人胚肾细胞株是研究Toll样受体（TLR）最常使用的细胞。为更好地认识其特性，我们进行了相关研究。一、材料与方法1．细胞培养及反转录一聚合酶链反应（1it—PCR）：人胚肾细胞株293T、293A、HEK293采用杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM）进行常规培养，总RNA抽提后行RT—PCR，引物均为自行设计。

骨髓间充质干细胞旁分泌因子治疗重症急性胰腺炎的潜能

骨髓间充质干细胞(BMSC)移植是重症急性胰腺炎(SAP)治疗的研究热点。但在临床应用中,该治疗方式却遇到了诸多技术及伦理问题。BMSC的旁分泌因子具有与细胞移植同样的疗效,且可减少上述生物安全问题,具有更安全、更易操控的治疗优势。本文就BMSC旁分泌因子在SAP中的治疗潜能作一综述,注射含旁分泌因子的BMSC培养上清有望成为未来SAP细胞治疗的新策略。

TLR4通路关键蛋白MyD88在坏死性小肠结肠炎发病过程中的作用机制研究

目的探究以MyD88为关键传导分子的TLR4下游炎症-凋亡信号通路在NEC发病过程中的作用机制。方法采用SPF级，新生10日龄MyD88^-／-幼鼠和相应的野生型幼鼠，共32只，分别按照数字表法随机分配进入NEC实验组或对照组；NEC实验组幼鼠置入自制新生保育箱内造模处理（每日人工配置鼠乳代用品喂养，5次／d；每次给予N2缺氧90S后，快速充入O2复氧，再次置入4℃环境冷刺激10min，3次／d，连续3d；LPS10mg／kg稀释于0．1ml灭菌水中，去芯留置针头口腔插管灌胃，1次／d，连续3d）；对照组继续与母鼠同笼，鼠乳喂养。实验结束后取材回肠末端肠管组织，HE染色法组织病理评分及液相芯片细胞因子TNF-α及IL-1β检测判断各组肠道NEC炎症程度。TUNEL方法检测各组小鼠肠道细胞的凋亡水平变化。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测各组小肠组织内TLR4炎症-凋亡通路中TRIF、IRF-3、NF-κb、Bax、Bcl-2、Caspases的mRNA表达情况。结果与野生鼠NEC组相比，MyD88敲除鼠小肠炎症程度评分（1．63±0．52比2．75±0．46）、炎症效应分子NF_小表达（1．38±0．25比2．33±0．76）、促炎因子IL-1β（465．57±81．59比863．58±198．28）、TNF-α（5．41±0．83比6．48±1．15）水平明显降低；肠上皮细胞凋亡明显减少（4．44±0．47比9．75±1．00），凋亡效应分子Caspases 8（2．03±0．20比4．06±0．44）、Caspases 9（1．02±0．08比1．93±0．09）、Caspases 3（1．87±0．28比6．75±1．12）和促凋亡基因Bax（1．15±0．25比2．40±0．42）表达降低（P〈0．05）。MyD88非依赖通路中关键因子TRIF（1．85±0．38比1．4±0．19）和IRF-3（2．01±0．41比1．53±0．38）表达上调（P〈0．05）；抗凋亡基因Bcl-2（1．18±0．31比1．10±0．20）表达无变化（P〉0．05）。结论①TLR4下游的MyD88-NF-κb信号通路是NEC发病过程中重要的炎症一凋亡调控机制；①MyD88在NEC发生过程中介导了Caspase 8-外源性及Caspase 9-内源性凋亡信号通路的激活过程；②MyD88敲除后，MyD88依赖性信号通路被阻断，MyD88非依赖通路被激活，NEC炎症程度及肠上皮细胞凋亡明显降低。

雨蛙素刺激大鼠胰腺腺泡细胞AR42J后对XIAP表达及细胞凋亡的影响

探讨雨蛙素（CAE）刺激大鼠胰腺腺泡细胞AR42J后,其X-连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）的表达变化规律及与细胞凋亡的关系。CAE刺激组及空白对照组,加药后继续培养12 h设为0 h时间点,分别在0、4、8、12及24 h收集细胞,电镜观察细胞超微结构变化,实时荧光定量PCR法检测XIAP及细胞凋亡指标caspase-3和caspase-9的mRNA表达,用Western blot法检测XIAP蛋白表达,用流式细胞术检测NF-κB激活率。结果发现,CAE刺激后,AR42J细胞凋亡在8 h最明显;XIAP表达随时间呈先降低后恢复的趋势,并在8 h达最低点（与其余各组差异均有统计学意义,P〈0.05）;caspase-3及caspase-9含量则随时间呈先升高后恢复的趋势,且与XIAP含量呈负相关（P〈0.001）;而NF-κB激活增加,并在4~8 h达高峰。由此推测,在CAE刺激所导致的炎症条件下,XIAP负向调控AR42J细胞的凋亡,而随着炎症的进展,NF-κB的激活逐渐增多,上调XIAP的表达,细胞凋亡指标的表达逐渐恢复。