两种蜘蛛毒素肽与苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白的融合表达及杀虫活性

蜘蛛毒液中含有多种杀虫肽,因而具有较强的杀虫作用,可迅速杀死农林害虫。蜘蛛毒素肽(ω-ACTX-Hv1a,ω-ACTX-Hv2a)是从澳大利亚的多能厚爪蛛Hadronyche versuta的毒液中分离获得,对昆虫有毒但对哺乳动物无毒。本文通过将人工合成的两种蜘蛛肽基因(hv1a、hv2a)与来源于对棉铃虫具有高活性的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)野生菌株NBIC380中的杀虫基因cry1Ac进行融合并在NBIC380中表达,获得了7种不同的重组菌株BtBM-Ve(含有空表达载体)、BtBM-Ac(含有cry1Ac基因)、BtBM-1a(含有hv1a基因)、BtBM-2a(含有hv2a基因)、BtA1a(含有cry1Ac+hv1a融合基因)、Bt A2a(含有cry1Ac+hv2a融合基因)和BtA(1+2)a(含有cry1Ac+hv1a+hv2a融合基因)。重组菌分别进行了棉铃虫Helicoverpaarmigera2龄幼虫、秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans和朱砂叶螨Tetranychuscinnabarinus的生物活性测定,结果显示BtBM-Ve无杀虫增效作用,BtBM-Ac、BtBM-1a、BtBM-2a、Bt A1a、BtA2a和BtA(1+2)a针对不同的虫源具有不同的杀虫增效活性,对3种害虫杀虫增效最多的重组菌是BtA(1+2)a,对棉铃虫2龄幼虫杀虫增效百分比为93.43%,对秀丽隐杆线虫为34.48%,对朱砂叶螨为13.46%。本文构建的基因工程菌对防治鳞翅目害虫、螨虫和线虫具有重要的理论意义和应用前景。

表达aiiA基因多黏芽胞杆菌工程菌构建与功能分析

AiiA蛋白能够专一性地水解革兰氏阴性菌分泌的信号分子,从而抑制其致病基因的表达,减弱致病性。根据NCBI上公布的蜡状芽胞杆菌ATCC14579的aiiA序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis NBIN-861中扩增得到aiiA基因(GenBank登录号:MG704113),全长基因约750 bp。将aiiA基因插入大肠杆菌表达载体pET-28a和芽胞杆菌表达载体pBMB1A中,构建重组表达载体pETaiiA和pBMaiiA,pETaiiA转化大肠杆菌BL21(DE3),pBMaiiA转化多黏类芽胞杆菌NR1,获得重组工程菌BLaiiA和BPaiiA。SDS-PAGE和蛋白质谱鉴定表明AiiA蛋白均成功表达,利用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有水解N-酰基高丝氨酸内酯活性。其中纯化的AiiA蛋白(1.13 mg/mL)和重组菌BPaiiA浓缩的发酵上清液中的AiiA蛋白活性较高(透明圈直径分别为16和18 mm),马铃薯致病性试验和抑菌试验结果表明该蛋白对胡萝卜欧文氏菌具有一定的抗病活性,但不具有抑菌活性。多黏芽胞杆菌NR1和重组菌BPaiiA发酵产生的抑菌物质含量均为1.2%～1.3%,具有良好的抑菌效果。本研究为构建更有效的生物防治菌株奠定了理论基础。

芽孢杆菌aiiA基因抗病研究进展

aii A基因编码的Aii A蛋白是一类由芽孢杆菌产生的酰基高丝氨酸内酯酶,能够专一性地水解革兰氏阴性菌分泌的AHLs信号分子,从而破坏依赖群体感应系统的致病机制,减轻病原菌的致病性。综述了aii A基因与Aii A蛋白的研究现状、aii A基因在抗病方面的研究进展及Aii A蛋白在工业发展的应用现状等,以期为aii A基因在更多领域的应用提供理论基础。