杨树重金属相关异戊二烯化植物蛋白(HIPPs)基因的鉴定及表达分析

金属伴侣在植物的生理活动中发挥关键作用,负责结合金属离子并将其转运至靶蛋白以维持细胞的金属离子稳态。目前关于HIPP(heavy metal-associated isoprenylated plant protein)金属伴侣蛋白的特性和功能分析多集中于模式植物拟南芥。本研究在毛果杨(Populus trichocarpa)中鉴定了14个PtHIPPs蛋白,均具有两个保守的金属离子结合基序MXCXXC,氨基末端可以形成βαββαβ二级结构,羧基末端具有保守的异戊二烯化基序;一些PtHIPPs还具有赖氨酸和/或甘氨酸富集区。根据基因结构、蛋白质的保守基序和进化树分析,PtHIPPs蛋白可分为3个亚组。PlantGenIE的组织特异性表达数据及荧光定量PCR鉴定结果显示,毛果杨PtHIPPs基因及小黑杨(Populus simonii×Populus nigra)PnHIPPs基因具有特定的组织表达特异性且存在差异。此外,利用缺铜及过量铜离子处理小黑杨植株不同时间后,不同组织部位中PnHIPPs基因的表达模式发生改变。本研究为鉴定木本模式植物杨树HIPPs蛋白在维持铜离子稳态过程中发挥的作用提供了参考依据。

植物的铜稳态研究综述

微量元素在植物生长发育过程中是必不可少的,因此研究植物内各种微量元素的稳态具有重要意义。铜在光合作用、呼吸作用、乙烯感应、活性氧清除和细胞壁重塑中发挥重要作用。铜的运输是由一组进化上高度保守的转运蛋白和金属伴侣共同完成的。由于根中转运蛋白的调控和高铜含量土壤非常稀缺,使得植物组织中的铜含量一般不会过高。然而,铜的利用率低会降低植物的生产能力。由于某些功能保守的基因的控制,植物会响应铜缺乏的外界环境。植物主要通过Ctr/COPT铜转运家族转运蛋白家族从细胞外吸收铜,之后由铜伴侣蛋白及P型ATP酶将铜运输到各细胞器中。铜在木质部的运输及铜从衰老叶片到嫩叶与生殖组织中进行的再分配都须要烟酰胺发挥作用。此外,铜的再分配过程须要黄色条纹状(yellow stripe-like,简称YSL)转运体及铜伴侣蛋白CCH的参与,其中CCH蛋白存在于植物的韧皮部。当铜供给不足时,植物中增加铜吸收的系统会被激活,并且使铜能更有效地被利用。一些参与铜调控的小分子RNA会下调某些不重要的铜蛋白的表达量。低铜条件下,主要的铜应答转录因子SPL7既可以激活参与铜吸收的基因的表达,又可以上调某些Cu-microRNAs的表达量。这种调节允许光合自养生物生长所需的最重要的含铜蛋白质(如质体蓝素)在一定的铜浓度范围内保持活性,这更有利于植物的生长。植物中铜过量会造成活性氧的快速积累,活性氧会破坏核酸、氧化蛋白并导致脂质过氧化,从而影响细胞的诸多功能,对细胞产生毒害。细胞内铜过量时会上调金属硫蛋白(metallothionein,简称MT)的表达以减少细胞质中游离铜离子的含量。主要阐述植物中铜稳态的作用及其研究进展,以及植物对铜的吸收与再分配过程,同时对铜在细胞内的传递及细胞内铜稳态的调控进行简单概述。并对大部分重要的含铜蛋白的研究进行简要描述。由于高等植物中铜蛋白的研究报道还较少,因此对植物中铜稳态的研究概述可以加强研究者对含铜蛋白质生物学功能的了解,同时也可以为进一步阐明植物吸收利用铜的分子机制提供依据。

小黑杨PnCCH10基因的克隆、功能初步鉴定及遗传转化

铜伴侣蛋白是细胞内结合并转运铜离子的低分子量蛋白质,在维持细胞铜稳态过程中发挥重要作用。CCH具有羧基末端伸长区,是植物细胞特有的铜伴侣蛋白。本研究通过RT-PCR方法克隆了小黑杨PnCCH10基因(登录号为MF977410)。序列分析表明,PnCCH10基因的开放阅读框为492 bp,编码的亲水性蛋白质含有163个氨基酸残基,分子量为18.7 kDa。PnCCH10蛋白的氨基端含有保守的MXCXXC铜离子结合基序且能够形成βαββαβ二级结构;PnCCH10与毛果杨PtCCH10蛋白的氨基酸序列同源性为99%,二者的进化关系最近。qRT-PCR鉴定结果显示,应答缺铜和高浓度铜离子胁迫,PnCCH10在小黑杨不同组织中的表达模式发生变化。酵母功能互补试验结果表明,PnCCH10具有抗氧化和铜伴侣功能。遗传转化后获得了过量表达PnCCH10基因的小黑杨转基因株系,且1、2、3、5、6、7和13号转基因株系的叶片和根中PnCCH10基因的表达量显著高于野生型植株。