免疫共沉淀联合质谱技术筛选蓝舌病病毒NS4蛋白的互作蛋白

[目的]筛选蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)NS4蛋白颉颃干扰素(interferon, IFN)信号通路的内源性互作蛋白,以便进一步研究NS4抑制IFN信号转导的作用机制。[方法]在前期仙台病毒(Sendai virus, SeV)诱导IFN信号通路基因表达研究基础上,利用免疫共沉淀方法从转染NS4融合eGFP标签表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP和pcDNA3.1-eGFP空载体的HEK-293T细胞中钓取NS4互作蛋白,对免疫沉淀物进行SDS-PAGE分析,免疫共沉淀洗脱液进行质谱鉴定及生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白的编码基因表达特征。[结果]通过免疫共沉淀及质谱鉴定分析和数据库比对,共获得189个差异表达蛋白。生物信息学分析结果显示,候选蛋白主要参与蛋白转录、翻译、病毒感染及免疫调控。亚细胞定位分析结果显示,差异表达蛋白主要定位于细胞核、细胞质以及胞质-胞核,筛选出4个与BTV NS4蛋白存在互作的候选蛋白:多聚嘧啶束结合蛋白1(PTBP1)、细胞周期依赖性蛋白激酶9(CDK9)、N-端豆蔻酰化酶1(NMT1)和Y盒结合蛋白1(YBX1)。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,SeV刺激72 h后,试验组PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9基因mRNA表达量均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01)。[结论]BTV NS4蛋白颉颃IFN信号通路与PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9蛋白表达上调有关,本试验结果为进一步研究BTV NS4蛋白颉颃宿主天然免疫应答的分子机制提供靶标参考。

蓝舌病病毒NS4蛋白亚细胞定位对Ⅰ型干扰素应答的影响

在前期仙台病毒诱导干扰素通路基因表达的研究基础上,通过免疫荧光及激光共聚焦显微镜观察,分析蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)NS4蛋白在仙台病毒诱导下表达及亚细胞定位特征;通过双荧光素酶报告系统和ELISA方法分析NS4蛋白对Ⅰ型IFN-β启动子活性的影响,Western blot分析对NS4 IFN通路中MDA5、TRAF6和ISG15蛋白表达的影响。免疫荧光共聚焦显微镜观察及Western blot结果显示,发现在仙台病毒诱导下在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP重组质粒48 h时发现强的绿色荧光信号,至72 h时绿色荧光信号主要集聚于细胞核内;Western blot分析结果显示在转染后的24,48及72h NS4蛋白的表达量呈时间依赖性上调表达,且在48和72 h抽提的细胞核蛋白中检测到大量的NS4重组蛋白;双荧光素酶报告系统试验显示NS4能显著抑制IFN-β启动子活性,ELISA结果显示NS4能显著抑制IFN-β蛋白的表达;Western blot分析干扰素信号通路MDA5、TRAF6及ISG15蛋白的表达,结果显示,NS4蛋白表达可下调SeV诱导的IFN信号通路中TRAF6、ISG15蛋白表达;灰度分析显示NS4表达极显著下调ISG15的表达。结果表明BTV NS4重组蛋白呈明显的核内定位特征,具有拮抗Ⅰ型IFN应答功能,为进一步研究BTV NS4蛋白拮抗宿主天然免疫应答的分子机制研究提供参考。