猪繁殖与呼吸综合征检测与监测技术要点

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的一种严重危害全球养猪生产的传染病,其主要危害是引起母猪繁殖障碍和生长猪呼吸道疾病以及发病猪群的继发感染。

1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解广东地区猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的流行情况并探究其分子生物学特征。【方法】采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定、遗传进化和关键氨基酸位点分析。【结果】样品经实时荧光定量RT-PCR检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1∶128;8个基因片段序列结果经BLAST比对和进化树分析显示,HA、NA基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H1N1)分支,PA、PB 1、PB 2、NP和M基因属pdm/09分支,NS基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/CJM2/2022(H1N1)。关键氨基酸位点分析显示,分离株HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR/GL,具有典型低致病性流感病毒的分子特征。HA基因在受体结合位点处的190、225、226位氨基酸分别为D、E、Q,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能。NA基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂的敏感性较高,而M基因3处氨基酸位点突变为V27A、A30T、D44A,提示对金刚烷胺类药物耐药性增加。【结论】本研究分离鉴定的毒株为G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,关键氨基酸位点分析提示该毒株具有适应在哺乳动物中复制和毒力增强的特征。本研究结果为广东地区猪流感的防控提供了参考数据。

酶解条件对花生粕水解液的抗氧化活性影响研究

以花生粕为原料,经Alcalase碱性蛋白酶水解,研究不同加酶量、底物浓度、酶解温度、酶解时间和酶解pH对花生粕水解液抗氧化性的影响。在单因素分析的基础上采用响应面分析方法对花生粕的酶解条件进行优化,以羟基自由基清除能力为考察指标,确定最佳的酶解条件为:加酶量11820U/g,底物浓度为7.52%,酶解温度为43.1℃,酶解时间为3.9h,酶解pH为8.47,羟基自由基清除能力为60.54%,在上述优化后的工艺条件下的验证实验测得羟基自由基清除能力为60.21%。

挤压膨化对酶解高温豆粕肽得率的影响研究

以大豆片为原料,利用双螺杆挤压膨化机进行实验研究,大豆片经挤压膨化、脱脂、高温脱溶得高温豆粕,研究不同物料含水量、套筒温度、模孔孔径和螺杆转速对酶解高温豆粕肽得率的影响。通过单因素和正交实验,确定最佳的挤压膨化参数为:物料含水量20%,套筒温度60℃,螺杆转速100r/min,模孔孔径15mm,肽得率36.88%。挤压膨化技术可以有效提高豆粕利用率,为今后工业化生产提供理论依据。

挤压膨化对酶解高温豆粕肽得率的影响研究

以大豆片为原料,利用双螺杆挤压膨化机进行实验研究,大豆片经挤压膨化、脱脂、高温脱溶得高温豆粕,研究不同物料含水量、套筒温度、模孔孔径和螺杆转速对酶解高温豆粕肽得率的影响。通过单因素和正交实验,确定最佳的挤压膨化参数为:物料含水量20%,套筒温度60℃,螺杆转速100 r/min,模孔孔径15 mm,肽得率36.88%。挤压膨化技术可以有效提高豆粕利用率,为今后工业化生产提供理论依据。

培养和提高大学生社会实践能力的研究

本文对提高大学生社会实践能力的作用进行了讨论,通过对当前大学生社会实践能力培养现状的调查,分析了大学生社会实践能力缺失的原因,提出进一步提高大学生社会实践能力的对策与建议。

中性蛋白酶脱脂辅助提取大豆皂苷的研究

以大豆胚芽为原料,利用酶法脱脂代替传统的溶剂脱脂,改良了大豆皂苷的提取方法。结果显示脱脂效果良好,并且脱脂过程发生在水解液中,有效地缩短了之后乙醇萃取的时间,有助于大豆皂苷的提取。最优的脱脂条件为:在温度40℃,底物浓度为17%的条件下,加入8000U/g的Protex7L中性蛋白酶,酶解5h,脱脂率为86.49%,大豆皂苷的提取率为73.54%。整个过程中没有利用任何有害的溶剂,几乎没有溶剂残留,绿色环保,产品品质优良。

巴泰病毒N_(5aa-90aa)重组肽段的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

巴泰病毒(BATV)是一种虫媒病毒,属于布尼亚病毒科成员,其核衣壳N蛋白具有高度保守性,可诱导机体产生较好的抗体反应,常用做诊断抗原。本研究通过对N蛋白强抗原性肽段N_(5aa-90aa)进行密码子优化,将其插入到pET-32a(+)载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达,通过不同IPTG浓度和诱导时间确定最佳蛋白表达条件。利用镍柱亲和层析方法对rHis-N_(5aa-90aa)肽段进行纯化。通过Western blot对rHis-N5aa-90aa肽段进行验证,将rHis-N_(5aa-90aa)肽段免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测定其抗体效价。结果显示:本研究成功构建了pET-32a-N_(5aa-90aa)重组质粒,在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、37℃诱导5 h可获得大量重组蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示重组rHis-N_(5aa-90aa)肽段分子质量约28.6 kDa,蛋白浓度为0.256 mg/mL;经Western blot分析纯化的rHis-N_(5aa-90aa)肽段与His-tag抗体呈阳性反应,证明rHis-N_(5aa-90aa)成功表达,间接ELISA测定制备的兔抗N_(5aa-90aa)肽段多克隆抗体的效价为1∶25600,并且Western blot和间接免疫荧光分析其具有良好的特异性。本研究表达并纯化了BATV的rHis-N_(5aa-90aa)肽段,为BATV的ELISA诊断方法的建立和基因疫苗的研制奠定基础。

现代农业观光园广场设计——以重庆旺龙湖观光农业大观苑广场为例

广场作为一种艺术建设类型,它既是承袭传统和历史、传递美的韵律和节奏的一种艺术形态,也是现代观光园构成的重要元素。在日益走向开放、多元、现代的今天,广场这一载体所蕴含的诸多信息,成为规划设计深入研究的课题。就重庆旺龙湖观光农业大观苑广场提出规划设计方案,将当地特色文化融入到广场设计中,充分展现当地的民俗风情和特色文化,达到对当地特色文化的弘扬和传承的目的。

廊坊地区地栽月季病虫害防治技术探究

近年来,月季被广泛栽植于廊坊地区的各公园与道路,但其易遭受病虫害侵袭,不利于绿化效果的发挥。文章对廊坊地区月季的主要病虫害种类及防治方法进行了阐述,主要病害包括白粉病、黑斑病、干腐病、霜霉病等,主要虫害包括蚜虫、棉铃虫(幼虫)、蓟马、红蜘蛛、槐尺蠖、绿盲蝽、金龟子、叶蜂、茎蜂等。这些病虫害会造成月季植株畸形、叶片扭曲失绿掉落、花蕾不开花、花朵受损凋零等,直接影响其观赏效果。可采取的防治方法有物理疗法、化学疗法、园艺疗法等。

现代月季在廊坊地区园林造景中的应用

自月季被确定为廊坊市市花以来,廊坊地区月季产业发展迅速,月季被广泛应用于城市及乡村景观建设中,市内大小公园、广场、游园、庭院、各街道等随处可见月季身影。本研究依托于廊坊市月季文化,旨在探讨现代月季在廊坊园林造景中应用的品类、原则、作用、应用、前景等,期望可以为廊坊市现代月季应用、发展提供思路。

理论、模式和实践三者的关系——以价值教育为例

在理论、模式与实践三者之间,理论是概括性的,模式介于理论与实践之间,发挥着承上启下的桥梁作用,并且包括概念模式和实践模式两种类型,用以给实践提供一种科学的指导和选择。本文以价值教育为例,来讨论当前理论、模式与实践三者之间的关系,以便于我们更好地认识三者之间的紧密联系。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法,根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,该方法建立的标准曲线在重组质粒浓度为1.019×10^(9)—1.019×10^(2)copies/μL时,相关系数R^(2)为0.998,Ct值和重组质粒浓度有良好的线性关系;与相关的其他5种羊常见病原无交叉反应,最低检测限度为10.19 copies/μL,组间和组内的变异系数均在1.5%内。利用本研究建立的方法与常规RT-PCR对20份临床样品进行对比检测,两种方法的ENTV-2阳性检出率分别为60%(12/20)和30%(6/20),两种方法的总符合率为70%(14/20)。结果表明,本研究建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ENTV-2的诊断和流行病学调查提供技术手段。

社区公园的特点、功能及需避免的问题

社区公园作为城市绿地的一个重要组成部分,是最为贴近居民日常生活的城市绿地之一。随着我国近年来经济的高速增长,人们对交往空间需求的增加、对人居环境的重视以及对户外娱乐交往休闲空间的渴求,国内的社区公园建设正在兴起。对社区公园进行简单介绍,并简述社区公园的作用与存在的问题。

橙皮素与铁蛋白的共价相互作用及其对铁蛋白理化性质的影响

以缺铁的铁蛋白和橙皮素为原料,在pH 9条件下制备铁蛋白-橙皮素共价复合物,探讨共价结合对蛋白结构和理化性质的影响。结果表明,橙皮素与铁蛋白的共价作用降低了铁蛋白的荧光强度并产生红移现象,改变了铁蛋白的结构。铁蛋白-橙皮素共价复合物的溶解度改变,等电点降低,其铁氧化沉淀活性提高,铁的还原释放活性降低。同时,共价复合物的热稳定性增强。铁蛋白-橙皮素复合物的形成赋予了铁蛋白新的功能特性,对探究食品组分相互作用,开发基于铁蛋白的相关食品或药品具有一定的理论指导。

2018年广东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因变异分析

为了解广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株ORF5基因遗传变异情况,采用RT-PCR对2018年采自广东部分地区疑似患有PRRS的猪肺组织样品进行PRRSV ORF5基因扩增以及克隆测序,并进行生物信息学分析。结果表明,成功扩增出18株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段。ORF5基因序列分析表明,18株PRRSV流行毒株ORF5基因核苷酸同源性为83.7%~99.8%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性为62.1%~99.8%。基于ORF5基因的遗传进化树分析表明,18株PRRSV流行株均为美洲型毒株。其中,10株与以JXA1为代表的高致病性毒株亲缘较近,2株与新型高致病性毒株FZ16A相似;1株与以NT1为代表的疫苗返强毒株亲缘较近,1株与以R98为代表的疫苗毒株亲缘性较近,4株与广东新报道的GM2和QYYZ毒株亲缘性较近。DNA推导氨基酸序列分析表明,18株流行株的氨基酸序列与国内已报道的代表株相比发生不同程度的变异,GP5抗原表位上存在着差异。研究结果揭示了广东地区PRRSV有新型强毒株、重组毒株以及疫苗返强毒株的流行,提示养殖者谨慎、合理使用疫苗,防止疫苗毒株返强和毒株重组,为该地区防控PRRS提供参考。

巴泰病毒研究进展

巴泰病毒(BATV)是一种虫媒病毒,属于布尼亚病毒科布尼亚病毒属成员,在世界范围内广泛存在。BATV可通过蚊虫传播给家畜、野生动物、家禽甚至人类等,并引起非特异性发热、脑膜炎和家禽产蛋量下降等症状。BATV基因组分3个节段。因此,可发生基因重配现象,产生新毒株并引起人类的发热甚至死亡,给公共卫生安全带来严重威胁。本文对BATV的病原学、临床症状、诊断和疫病防控等方面进行了简要的阐述,以期为预防和控制病毒的出现和流行提供参考。

巴泰病毒G1_(189aa-239aa)肽段的原核表达、纯化及间接ELISA方法的建立

本研究旨在获得高纯度巴泰病毒(Batai virus,BATV)G1蛋白强抗原性肽段,并建立一种用于检测BATV羊血清抗体的间接ELISA方法。首先对G1蛋白51个氨基酸编码的189-239位氨基酸强抗原肽段进行密码子优化,基因合成后构建重组表达质粒pET-32a-G1_(189aa-239aa),转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达。优化表达条件获得大量rHis-G1_(189aa-239aa)肽段,利用镍柱亲和层析方法进行纯化,并用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。通过Western blotting对rHis-G1_(189aa-239aa)肽段进行抗原特异性分析,以rHis-G1_(189aa-239aa)肽段为抗原,羊BATV阳性血清作为抗体,通过方阵滴定优化反应条件,建立BATV间接ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,rHis-G1_(189aa-239aa)肽段在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,分子质量为24.5 ku,在0.1 mmol/L的IPTG诱导5 h后rHis-G1_(189aa-239aa)肽段表达量达到峰值。通过镍柱亲和层析纯化后,测得蛋白浓度为0.296 mg/mL。Western blotting结果显示,rHis-G1_(189aa-239aa)肽段特异性较好。以rHis-G1_(189aa-239aa)肽段为抗原建立的间接ELISA方法,通过条件优化确定最佳抗原包被浓度为2.5μg/mL,血清和二抗稀释度为1∶60和1∶10000。样品D450 nm值≥0.367为阳性,D450 nm值≤0.319为阴性。该方法与山羊痘病毒和布鲁氏杆菌的阳性血清均无交叉反应,批内和批间的变异系数均<10%,阳性血清最高可稀释至1600倍,该方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的特点。利用本方法对云南地区的120份羊血清样本进行检测,血清阳性率为21.67%。本研究获得了特异性强和纯度较高的rHis-G1_(189aa-239aa)肽段,建立了间接ELISA方法,可应用于羊BATV血清流行病学调查,为疫病防控及致病机制研究奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒与副猪嗜血杆菌混合感染的诊断

为确诊广东省阳江市某规模化猪场(存栏800头母猪)保育猪发病死亡的原因,本试验对从该发病猪场采集的3份肺脏、肝脏、脾脏临床样品进行细菌学检测及药敏试验,采用PCR/RT-PCR检测临床样品中猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)和猪肺炎支原体等病原。对特异性扩增的3株PRRSV的ORF5基因产物进行序列测定,与VR2332、HuN4、JXA1、CH-1a等代表毒株进行核苷酸序列同源性分析,并构建系统进化树。结果表明,试验分离鉴定出1株副猪嗜血杆菌(Hps),对7种临床常用药如阿莫西林、头孢拉定等均有较强的敏感性。同源性比对结果表明,3株PRRSV(LJW1、LJW2和LJW3)ORF5基因核苷酸同源性为99.3%~99.8%,与欧洲型代表毒株Lelystad核苷酸同源性为64.0%~64.2%,与HP-PRRSV毒株JXA1、HuN4、CH-1a和TJ核苷酸同源性较高,分别为99.2%~99.5%、99.0%~99.3%、94.5%~94.9%和98.8%~99.2%;与中国河南和广西分离的HP-PRRSV毒株HeNzm1-16和GXLZ05-2015核苷酸同源性较高,分别为99.3%~99.7%和99.2%~99.7%,与美洲型经典疫苗株MLV、美洲型标准株NC、美洲型经典株VR2332核苷酸同源性较低,分别为88.5%~88.8%、85.2%~85.5%和82.3%~82.6%。PRRSV ORF5基因系统进化树分析表明,3株PRRSV均属于美洲型毒株,与国内HP-PRRSV代表毒株JXA1、HuN4和TJ等处于同一分支,亲缘关系较近。本研究揭示了该场保育猪发病病原,并从分子水平上明确了分离的3株PRRSV与不同代表毒株的亲缘关系,为弱毒疫苗的合理选择使用和综合防控PRRSV提供了参考依据。

鳜源维氏气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

从发病鳜鱼中分离到1株优势菌(ZQ202010),进行剖检、细菌分离培养、革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA及gyr B基因测序、动物致病性试验、毒力检测和药敏试验。结果显示,分离株ZQ202010为革兰氏阴性小杆菌,具有运动性,该分离菌赖氨酸脱羧酶、氧化酶、VP、吲哚等反应呈阳性;精氨酸水解酶、硫化氢等反应呈阴性;16S rRNA及gyr B基因序列与维氏气单胞菌同源性均大于99%,且在系统进化树上与维氏气单胞菌处于同一分支;动物致病性试验表明分离株对鳜鱼有较强的致病性,对鳜鱼的半数致死量为4.09×10^(6) CFU,毒力检测显示分离菌携带aer A、alt、fla、exu、ser、ahy B和lip共7个毒力基因,说明分离菌具有较强毒力。分离菌对头孢拉定、替米考星、头孢曲松、氟苯尼考、强力霉素等药物敏感,对环丙沙星、头孢噻肟、青霉素、阿莫西林/克拉维酸、恩诺沙星、复方磺胺甲噁唑、利福平和氧氟沙星等8种药物耐药。研究结果可为鳜源维氏气单胞菌的防控提供依据。