重组左聚糖蔗糖酶生产左聚糖工艺优化

利用5 000 L发酵罐中试所得的大肠杆菌重组枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶酶制剂转化蔗糖生产左聚糖,并优化其工艺条件。选择反应pH值、反应温度和蔗糖质量浓度为主要影响因素,分别以蔗糖转化率和左聚糖产量为响应值,利用Box-Behnken响应面试验对酶法合成左聚糖工艺条件进行优化。响应面试验结果表明:在重组左聚糖蔗糖酶浓度1.6 U/mL、反应pH6.3、反应温度26℃、410 g/L蔗糖的条件下反应30 h,得到的左聚糖产量最高,为(138.59±2.90)g/L,比优化前提高了约80%。在酶浓度1.6 U/mL、反应pH6.5、反应温度24℃、310 g/L蔗糖的条件下反应30 h,得到最高蔗糖转化率(36.73±0.60)%,比优化前提高了约19%。上述优化条件在5 L反应体系中可保持稳定的生产效率,为规模化酶法生产左聚糖的工业应用提供了技术基础。

RT-qPCR分析拷贝数及mRNA转录水平对表达左聚糖蔗糖酶的影响

采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术对重组毕赤酵母基因组中左聚糖蔗糖酶基因(SacB)的拷贝数及信使核糖核酸(mRNA)转录水平进行检测分析,并用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定菌株不同诱导时间下左聚糖蔗糖酶水解活力。结果表明,在BMMY液体培养基中经甲醇诱导24 h时,样品转录水平皆达到最大值,此时多拷贝菌株转录水平(2.13)为单拷贝菌株(0.42)的5.1倍;左聚糖蔗糖酶活力在甲醇诱导24 h后均随诱导时间不断上升,多拷贝菌株酶活(13.96 U/mL)较单拷贝菌株(5.48 U/mL)提高1.5倍。重组毕赤酵母整合的左聚糖蔗糖酶基因在1~3个拷贝范围内,随着拷贝数增加,多拷贝菌株较单拷贝菌株的mRNA转录水平及相应的蛋白表达量均显著增加(P<0.05),说明毕赤酵母是表达基因SacB的良好宿主。

油茶壳堆肥微生物的培养及功能芽孢杆菌的筛选和初步应用

【目的】从自然状态下的油茶壳堆肥产品中筛选功能芽孢杆菌,为油茶壳堆肥高效生产、饲料发酵等应用提供菌剂。【方法】利用高通量测序技术测定广西某油茶壳堆肥中微生物群落分布,筛选适宜堆肥微生物生长的培养基以获得多样性较丰富的堆肥芽孢杆菌菌群,经平板稀释涂布法分离纯化菌株,使用水解圈法和酶活测定方法进行水解酶功能分析,利用菌株形态特征观察、16S rDNA分子鉴定法明确菌株的种属,并运用分子生物学软件MEGAX构建系统发育树。使用重铬酸钾法测定腐殖酸含量。【结果】芽孢杆菌科(Bacillaceae)是优势菌科,占比达55.58%;分离到15株芽孢杆菌,同时具有淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶3种水解酶活性的菌株有6株;同时具有淀粉酶和纤维素酶活性的有1株;仅具有蛋白酶或纤维素酶一种酶活性的有2株。其中菌株Bacillus sp.YX11的蛋白酶活力达到27.07±3.28 U·mL^(-1),淀粉酶活力达123.97±3.19 U·mL^(-1),纤维素酶活力达15.75±0.23 U·mL^(-1)。含有这15株菌的复合菌制剂有利于腐殖酸的生成,提高了堆肥品质。【结论】鉴定出的Bacillus cereus YX02和Bacillus flexus FYF01等菌株具有进一步研究开发的价值,可用于开发油茶壳堆肥微生物菌制剂。

Bacillus paralicheniformis左聚糖蔗糖酶基因克隆表达及酶学性质研究

[目的]从耐热菌株中克隆表达左聚糖蔗糖酶基因,以获得热稳定性较好、底物耐受性高的重组酶,为左聚糖蔗糖酶催化机理及生产应用研究提供技术基础。[方法]从市售菌肥中筛选耐热菌株并克隆其左聚糖蔗糖酶基因,以pSE380为载体构建重组质粒并转化至大肠杆菌诱导表达,随后通过镍亲和层析获得电泳纯的重组左聚糖蔗糖酶并研究其酶学性质。[结果]分离到耐热菌株LN-05,经16S rDNA序列分析鉴定为Bacillus paralicheniformis。克隆表达的B.paralicheniformis左聚糖蔗糖酶与已公布地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) RN-01的左聚糖蔗糖酶存在19个氨基酸残基差异。重组酶催化水解反应最适pH为6.0,最适温度为45℃,于40和45℃保温3 h后残余酶活力分别为89%和78%。Mn^2+、Ag^3+和Cr^2+对重组左聚糖蔗糖酶的水解活力有明显抑制作用,Co^2+和Al3^+对水解活力具有一定促进效果;Ba^2+、Mg^2+和Mn^2+对聚合活力有明显抑制作用,Ag^3+、Cu^2+和K^+对聚合活力具有促进作用。EDTA对重组酶水解活力和聚合活力均具有抑制作用。在最适条件下,重组左聚糖蔗糖酶的最大反应速率(V(max))=74μmol/(min·mg),米氏常数(Km)为7.57 mmol/L。催化聚合反应的最适温度随着底物蔗糖浓度而变化,当蔗糖浓度为50%时,最适温度为40℃;最适聚合反应pH为5.0;当酶浓度为0.9 U/mL,在最适条件下反应24 h,左聚糖产糖量达183.00±1.73 g/L,蔗糖转化率为(36.76±1.84)%。[结论]B.paralicheniformis左聚糖蔗糖酶的热稳定性较好,左聚糖产量高,具有转化蔗糖生产高附加值左聚糖的应用潜力。

酶法合成左聚糖的乙醇提取工艺研究

左聚糖(Levan)是一类主链为β-(2,6)糖苷键和侧链含少量β-(2,1)糖苷键的果聚糖,在医药、食品、化妆品等多个领域都有着良好的应用潜力。左聚糖蔗糖酶(Levansucrase)能以蔗糖为底物转果糖基合成左聚糖。酶法合成左聚糖在规模工业化生产左聚糖方面具有很大的优势。本文研究不同底物浓度下酶法合成左聚糖的乙醇提取工艺,结果表明在30%底物浓度下酶催化蔗糖合成左聚糖,反应结束后采用2.5倍体积乙醇沉淀得粗左聚糖,再重新溶解并用乙醇沉淀提取2次可得到纯左聚糖,总回收率可达到77.4%,产品中未测出还原糖和蛋白质。本文为酶法合成左聚糖工业应用的下游处理工艺提供了应用研究基础。