福建省茶树病毒种类鉴定及多重PCR检测技术的建立

【目的】明确福建省茶树主要病毒种类和分布情况,并建立同时快速检测多种病毒的多重PCR检测技术。【方法】2019—2023年,从福建省福州、南平、宁德、泉州、漳州、厦门、三明、莆田和龙岩9个地市区采集具有褪绿、皱缩和坏死等疑似病毒感染症状的茶树样品1869份,采用高通量测序技术结合PCR和RT-PCR检测的方法对茶树病毒病的病原进行鉴定,并将PCR扩增获得的特异性目的片段进行克隆和测序,对获得的序列进行系统发育分析;同时,根据GenBank上已报道的病毒序列设计特异性引物,通过退火温度、引物浓度、循环数等反应条件和反应程序的优化,建立同时检测福建茶树主要病毒的多重PCR检测技术,并测定该技术的特异性、灵敏度及实际应用效果。【结果】从所采集的茶树病样上检出3种病毒,按检出率从高到低依次为油茶双生病毒(oil tea associated geminivirus,OTaGV)(48.90%)、茶树坏死环斑病毒(tea plant necrotic ring blotch virus,TPNRBV)(26.75%)和茶树潜隐病毒1(camellia cryptic virus 1,CCV1)(17.98%);在检出病毒的1258份样品中,有807份为OTaGV、TPNRBV或CCV1单独侵染,检出率分别为37.20%、21.38%和5.56%;其余451份样品为2种或3种病毒复合侵染,复合侵染检出率达35.85%,OTaGV+CCV1、TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、OTaGV+CCV1+TPNRBV 4种类型复合侵染检出率分别为17.49%、0.40%、14.71%、3.26%。在地理分布上,OTaGV在福州、南平、宁德、泉州、漳州、厦门、三明、莆田和龙岩9个地区均有分布,其中漳州OTaGV检出率最高,为96.77%;CCV1在福州、南平、宁德、泉州、漳州、三明、莆田和龙岩8个地区均有分布,其中三明CCV1检出率最高,为66.00%;TPNRBV在福州、南平、宁德、泉州和漳州5个地区均有分布,其中泉州TPNRBV检出率最高,为79.13%;在福建省9个地区中,厦门地区仅检出OTaGV,三明、莆田和龙岩地区检出OTaGV和CCV1,其他5个地区同时检出OTaGV、TPNRBV和CCV1;福州、南平、宁德、泉州、漳州、三明、莆田7个地区检测到病毒复合侵染,其中漳州地区病毒复合侵染检出率最高(85.00%)、宁德地区病毒复合侵染检出率最低(23.03%)。利用测定的CCV1和TPNRBV部分基因序列构建系统发育树,结果表明本研究获得的CCV1分离物(FW)与已报道的福建分离物FJ-SH104(GenBank登录号:ON807095)亲缘关系最近、TPNRBV分离物(FU)与福建分离物QZHA92(GenBank登录号:OQ948454)亲缘关系最近。经优化建立的多重PCR检测技术特异性强,仅OTaGV、TPNRBV和CCV1能扩增出特异性目的片段,而其他病毒及健康茶树样品上均未扩增出特异性目的片段;多重PCR灵敏度最低可以检测到稀释至10^(-4)倍的OTaGV、TPNRBV和10^(-3)倍的CCV1;利用该多重PCR检测技术对茶园中采集的60份病样进行检测,检测结果与单一PCR检测结果完全相符。【结论】OTaGV、TPNRBV和CCV1是当前福建茶树上主要病毒种类,其中OTaGV为福建地区首次报道,该病毒可侵染茶树也为首次发现;在检出的3种病毒中,以OTaGV发生分布范围最广,其次为CCV1、TPNRBV;福建地区茶树病毒目前仍以单独侵染为主,但同时存在较多的复合侵染,复合侵染类型包括TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、CCV1+OTaGV和OTaGV+CCV1+TPNRBV;建立的多重PCR检测技术特异性强、灵敏度高,可用于茶园茶树上OTaGV、CCV1和TPNRBV3种病毒的快速检测。研究结果可为福建茶树病毒病的综合防控提供理论依据和技术支持。

美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测方法的建立

本文以我国台湾进境美人蕉病株为材料,根据已报道的美人蕉黄斑驳病毒Canna yellow mottle virus(CaYMV)基因序列设计2对特异性引物(外侧引物1对、内侧引物1对),建立了巢式PCR快速检测CaYMV的方法,并对进境的50份美人蕉样品进行了检测。结果显示,该方法特异性强,且灵敏度高于常规PCR,是常规PCR的1 000倍,表明该方法能够实现对CaYMV的快速、准确、灵敏检测,适用于口岸快速检测CaYMV。

福建省一种蓝莓枝枯病病原鉴定

【目的】明确福建省三明地区蓝莓枝枯病的病原菌,为该病害的有效防治提供理论依据。【方法】采集受害蓝莓枝条样品,通过常规组织分离法进行病原菌分离纯化,采用针刺法进行致病性测定完成柯赫氏法则验证,利用形态学特征并联合分子生物学,明确致病菌的分类地位。【结果】从病组织中分离获得菌株KW1-4,将其回接至健康蓝莓枝条后,接种部位出现干枯病斑,再次分离获得的菌株与接种菌株一致,表明该菌株是引起蓝莓枝枯病的病原菌。菌株KW1-4菌落圆形,白色至灰色,有2种类型分生孢子,α型分生孢子长椭圆形至梭形,具2个明显油球,(4.77~7.63)μm×(1.55~2.71)μm,β型分生孢子线形,无油球,(11.95~19.65)μm×(1.05~1.94)μm。采用ITS,TEF1-ɑ,β-tubulin3段基因联合构建系统发育树,供试菌株KW1-4与Diaporthe australiana聚在同一分支。对比形态学特征,确定菌株KW1-4为间座壳属真菌Diaporthe australiana。【结论】引起福建省三明市蓝莓枝枯病的病原菌是Diaporthe australiana,本研究首次报道Diaporthe australiana能够侵染蓝莓枝条。

教育投入对福建经济增长贡献率的实证分析

借鉴丹尼森劳动要素二分法,引入教育经费投入变量,扩展C-D生产函数,对福建省1980～2007年经济数据进行计量分析,表明教育投入与福建省经济产出高度相关,二者存在着Granger因果关系。教育投入对福建省经济增长速度的贡献率是12.34%,低于资本和技术进步因素的贡献水平。教育因素对福建经济增长贡献较低的主要原因是教育投入总量不足、资源配置失当、产出结构失衡以及人才培养规划滞后。

中国钢铁产业集中度与利润率的关系研究

在产业集中度与利润率的关系研究中,国内外学者的研究中大致存在两种不同的观点,为了进一步验证二者的相关性,采用直观的数据图表分析方法,通过横向和纵向比较分析我国钢铁行业集中度,并以年份为临界点研究钢铁产业集中度与利润率的关系及其成因,由此探究提高钢铁产业集中度的建议。

136例人工荨麻疹的护理体会

目的为观察应用心理护理联合药物治疗人工荨麻疹患者的效果。方法通过对136例人工荨麻疹的治疗观察分析。结果与结论人工荨麻疹患者在联合药物治疗同时,采用个体化有针对性的护理,收到了良好的效果。

福建省福清地区马铃薯病毒病病原的分子检测

2017年调查福建福清地区马铃薯病毒病的发生情况,以明确该地区马铃薯主要病毒病原。共采集了46份疑似感染病毒的马铃薯植株,提取总RNA,利用RT-PCR技术进行分子检测,结果表明,福清地区危害马铃薯的病毒有马铃薯Y病毒Potato virus Y(PVY)、马铃薯卷叶病毒Potato leaf roll virus(PLRV)、马铃薯S病毒Potato virus S(PVS),检出率分别为56.52%、17.39%和10.87%,以PVY检出率最高,说明PVY是危害该地区马铃薯样品的主要病毒病原。通过病毒复合侵染进行分析,发现该地区存在病毒复合侵染马铃薯现象。研究结果可为福清地区马铃薯种薯的引进和病毒病害防治提供参考依据。

福建永安市辣椒丛枝病植原体的分子检测及鉴定

永安地区发病辣椒植株表现小叶、黄化、丛枝、簇芽等症状。利用植原体16SrDNA基因的通用引物R16mF2/R16mR2和R16F2n/R16R2,对发病辣椒植株总DNA进行巢式PCR检测,获得约1.2kb的特异性DNA片段。经测序并在GenBank数据库进行比对分析,共获得4条植原体特定的16SrDNA基因序列(CHY-C4-1、CHYY1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1)。将测得的4条序列与已报道的植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,结果显示获得的4条植原体序列均聚类到16SrI组,其中CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1与16SrI-B亚组植原体聚类到同一支,而CHY-C4-1与已报道的16SrI组内的6个亚组均未聚类到一支,因此建议将CHY-C4-1命名为新的亚组。利用iPhyClassifier在线分析软件对获得的4条植原体序列进行虚拟RFLP分析,结果与进化树获得的结果一致。

番红花种球中虎眼万年青花叶病毒的分子鉴定与序列分析

【目的】对一批荷兰进境番红花种球(Crocus sativus)进行病毒鉴定,以防止危险性病毒传入危害。【方法】根据已报道的马铃薯Y病毒科(Potyviridae)通用引物(Sprimer和M4T),采用RT-PCR方法对一批番红花种球样品进行检测,取其中一个RT-PCR产物进行克隆测序,利用Gen Bank上的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)和MEGA 6中的基于对数期望的多重序列比较(Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation,MUSCLE)进行序列比对分析,并根据外壳蛋白基因(coat protein,CP)序列利用最大似然法(maximum likelihood method)进行系统发育分析。【结果】RT-PCR检测结果显示该批样品扩增到一条约1.7 kb的预期大小片段,说明该批番红花种球样品中存在Potyviridae科病毒。测序获得长度为1 666bp的序列(命名为2677-NL),含有部分核内含体b基因(nuclear inclusion b,NIb)、完整的CP和3′端非编码区(3′-UTR),其核苷酸序列与虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)的SW3.3分离物具有最高序列一致性(99.6%),与Or MV参考基因组序列(Reference genomic sequences,Ref Seq;NC_019409)的序列一致性为99.1%。该分离物的CP与6个Or MV印度分离物(JQ686722、JQ686720、JN692498、JN692497、JN692496、JF682235)的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为71.5%—77.3%和65.7%—79.7%,与其他32个Or MV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为77.9%—99.5%和82.9%—99.2%。基于CP进行的系统发育分析表明,Or MV可分为两个类群,而2677-NL与5个澳大利亚分离物(JQ807995、JQ807996、NC_019409、AF185964、AF185965)相聚成簇,表明其在系统发育关系上与Or MV澳大利亚分离物的亲缘关系最近。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyviridae科病毒种类的分类标准,2677-NL为Or MV的一个分离物,证实该批番红花种球受到Or MV的侵染。这是世界上首次在番红花中发现Or MV的报道。

来自台湾地区番荔枝果实上可可花瘿病菌的检疫鉴定

【目的】从台湾进境的番荔枝果实样品上发现带有黑褐色、不规则病斑的病果,对其进行病原菌分离鉴定,以明确其病原种类及分类地位。【方法】采用常规PDA平板分离法获得1株疑似可可花瘿病菌(Albonectria rigidiuscula)菌株2268-2-2-3,通过形态学特征观察、序列比对分析及致病性测定的方法对其进行了鉴定。【结果】分离菌株在PDA平板上菌丝生长茂盛,菌落呈粉色,可产生大量大型分生孢子和小型分生孢子,大型分生孢子镰刀形或稍弯的柱形,具5~9个隔,大小为(52.98~76.33)μm×(5.38~8.56)μm,小型分生孢子椭圆形至圆柱形,有0~1个隔,大小(4.95~10.38)μm×(2.61~5.12)μm,培养期间未见有性阶段。经rDNA基因间隔序列(ITS)和翻译延长因子基因序列(EF1A)比对分析,发现该菌株与GenBank中多个可可花瘿病菌(A.rigidiuscula)菌株的ITS和EF1A基因序列同源性超过98%。根据EF1A序列构建的系统进化树表明,该菌株与其他多株可可花瘿病菌(A.rigidiuscula)分离物EF1A序列聚在同一个分枝上。致病性测定结果表明菌株2268-2-2-3可侵染释迦果实,形成黑褐色不规则病斑。以上研究结果表明台湾地区释迦果上分离获得的菌株2268-2-2-3为可可花瘿病菌(A.rigidiuscula)。【结论】采用形态学、序列分析、致病性测定相结合的方法,准确截获鉴定了来自台湾地区释迦果上的可可花瘿病菌。可可花瘿病菌是我国进境检疫性植物病原真菌,研究为口岸检疫以及该病菌的防控工作提供了重要参考。

建兰花叶病毒的遗传变异及其寄主适应性

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)是危害兰花并造成重要经济损失的病毒之一。为揭示CymMV的遗传变异及其适应性进化特征,新测定了16个CymMV石斛兰(Dendrobium nobile)分离物的外壳蛋白基因(coat protein,CP)序列,并结合已报道的52个CymMV中国分离物CP基因序列进行遗传变异及进化分析。遗传多样性分析结果显示,68个CymMV分离物CP基因的核苷酸多样性(Pi)和单倍型多样性(Hd)平均值分别为0.039和0.992,表明该病毒具有较高的遗传多样性。分子变异分析(analysis of molecular variance,AMOVA)显示,CymMV变异源主要来自于病毒个体,约占总变异的71.72%。群体遗传结构分析显示,该病毒可以分为两个大簇(Cluster),CymMV建兰(Cymbidium ensifolium)分离物独立为一簇(Cluster 1),其他寄主分离物聚为另一大簇(Cluster 2),Cluster2内相同寄主来源的病毒分离物倾向于相聚成簇。进一步的系统发育与性状关联分析结果显示CymMV与寄主来源存在显著的关联性。上述结果表明,CymMV的遗传变异具有寄主特异性,其适应性进化主要受寄主因素所驱动。

西番莲病毒可视化多重RT-LAMP检测技术的建立

东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)、夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,TeMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是当前危害我国西番莲的主要病毒种类。为建立同时快速检测西番莲上EAPV、TeMV和CMV的可视化多重逆转录环介导等温核酸扩增(Multiplex reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,multiplex RT-LAMP)技术,本研究根据GenBank已报道的EAPV、TeMV和CMV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列保守区域分别设计、筛选特异性引物,并通过反应体系和反应条件的优化,建立了可同时快速检测EAPV、TeMV和CMV的多重RT-LAMP技术,并进行了特异性、灵敏度测定及西番莲果园样品的检测。结果表明,建立的多重RT-LAMP方法特异性良好,可对EAPV、TeMV和CMV同时进行检测,而与西番莲上其他病毒及阴性对照无交叉反应;多重RT-LAMP的灵敏度最低可检测稀释至145×10-3 ng/μL总RNA,与一步法RT-PCR方法的灵敏度相当;西番莲果园样品3种病毒的多重RT-LAMP检测结果与一步法RT-PCR检测结果一致。本研究建立的多重RT-LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,适用于基层实验室和现场对西番莲上EAPV、TeMV和CMV的快速初筛。

蚕豆染色病毒RNA2全序列测定

采用RT-PCR扩增并测定蚕豆染色病毒(Broad bean stain virus,BBSV)RNA2的基因组序列。BBSV RNA2基因组全长3478 nt,5'非编码区和3'非编码区分别为268 nt和237 nt。RNA2编码的多聚蛋白经切割后产生辅助蛋白(CR)、移动蛋白(MP)、大外壳蛋白(CP-L)和小外壳蛋白(CP-S)。基于多聚蛋白P2氨基酸序列构建的系统树显示:侵染豆科作物的Comovirus病毒构成1个分支,表明Comovirus病毒之间的亲缘关系具有寄主相关性。

福建茶树潜隐病毒1的检测及全基因组序列特征

为明确福建茶树潜隐病毒(camellia cryptic virus 1,CCV1)发生情况,探明其全基因组序列特征及其与油茶潜隐病毒1(camellia oleifera cryptic virus 1,CoCV1)的关系,本研究通过RT-PCR方法对采自福建7个茶树种植区疑似感染CCV1的叶片进行检测,并随机选取18个CCV1分离物,经扩增、克隆获得全基因组序列,对其序列特征和系统发育关系进行分析。结果显示,431份样品中共有94份样品检测出CCV1,检出率为21.81%。测定获得的18个CCV1分离物dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3的核苷酸序列全长分别为1722-1725 bp、1504-1506 bp和1497-1499 bp。克隆获得的RdRp、CP和mCP的氨基酸序列与CCV1代表分离物Won(GenBank登录号MH898482-MH898484)和CoCV1代表分离物PXCS5(GenBank登录号MH814756-MH814758)的一致性值分别≥91%、≥84%和≥90%,超过了δ-分体病毒属(Deltapartitivirus)中种的界定标准阈值。进一步的系统发育分析结果显示,所有CCV1分离物与CoCV1分离物以高置信值相聚成簇,证实CCV1和CoCV1为Deltapartitivirus属的同一种病毒。

全国口岸首次在进境番红花种球中截获植物病毒——虎眼万年青花叶病毒

番红花（Crocus sativus L．），又名藏红花、西红花，为鸢尾科（Iridaceae）多年生珍贵药用草本植物或观赏植物。2014年1月，机场局在香港至厦门的KA618次航班旅客行李中截获一袋来自荷兰的番红花种球。经植检实验室鉴定，从该批番红花种球中检出南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）和虎眼万年青花叶病毒（Ornithogalum mosaic virus，OrMV），这是全国口岸首次在进境番红花种球中截获植物病毒的记录。

火龙果细菌性软腐病菌的分离与鉴定

火龙果（Hylocereus undatus Britt．et Rose）属仙人掌科三角柱属植物，是集水果、花卉、蔬菜、保健为一体的热带亚热带果树，在中美洲、美国南部地区，以及以色列、越南、泰国和我国的台湾、海南、广东、福建等地均有种植。近年来，随着火龙果种植面积不断扩大，火龙果病害呈逐渐加重趋势．严重威胁火龙果的产业发展。

福建口岸首次从日本进境水仙种球上截获4种病毒

2016年3月,福建出入境检验检疫局技术中心采用血清学ELISA、电镜观察及分子生物学RT-PCR方法从一批旅检截获的日本进境水仙种球上检出水仙普通潜隐病毒（Narcissus common latent virus,NCLV）、水仙退化病毒（Narcissus degeneration virus,NDV）、水仙迟季黄化病毒（Narcissus late seasonvellows virus．NLSYV）和水仙黄条病毒（Narcissus yellow stripe virus，NYSV）4种病毒，这是福建口岸首次从日本进境水仙种球上检出病毒类有害生物，其中NCLV、NDV为我国口岸首次检出。NCLV属于乙型线状病毒科（Betaflexiviridae）香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）成员，NDV、NLSYV、NYSV3种病毒属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，4种病毒均可通过带毒水仙种球进行远距离传播，并常复合侵染水仙，影响水仙的生长安全和观赏价值，发生严重时，对水仙的球茎产量能够造成较大的损失。水仙是福建省省花、同时也是我国传统出口花卉，为防范国外水仙病毒传人，保护福建省特色花卉。福建检验检疫部门已对该批带毒水仙种球作销毁处理。

双重RT-PCR快速检测水仙普通潜隐病毒和尼润潜隐病毒

目的:针对水仙上水仙普通潜隐病毒(Narcissus common latent virus, NCLV)和尼润潜隐病毒(Nerine latent virus, NeLV)建立同时检测两种病毒的双重RT-PCR方法。方法:参照GenBank上已报道的NCLV和NeLV CP基因序列设计特异性引物,在单一RT-PCR检测方法的基础上,通过对PCR反应体系和反应条件的优化,建立了可以同时检测NCLV和NeLV的双重RT-PCR方法,并对其特异性、灵敏度进行了测定,同时应用于水仙实际样品的检测。结果:建立的双重RT-PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏度,能够有效区分水仙上NCLV、NeLV两种病毒,并且检测灵敏度不低于单一RT-PCR,水仙实际样品检测结果与单一RT-PCR检测结果相符。结论:建立的NCLV、NeLV双重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、准确性好,适用于口岸及农业生产上NCLV、NeLV的快速检测。