盘基网柄菌allC的克隆、表达和多克隆抗体的制备

运用RT-PCR技术从盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)总mRNA中克隆到了尿囊酸酶基因(allC),该基因编码区开放读框长1 100bp,编码的蛋白约42kD.由于是在野生型和突变型细胞中差异表达的片段,表明该基因在盘基网柄菌多细胞发育中起到重要作用,因此将allC克隆入融合表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达带有6个组氨酸标签的尿囊酸酶(ALC)融合蛋白,经镍柱亲和层析,获得了电泳纯蛋白.用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.ELISA测得制备的抗ALC蛋白的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,Western Blotting检测证明该抗体有较强的针对ALC蛋白的专一性.这些数据表明重组质粒表达的ALC融合蛋白具有良好的抗原性,制备ALC的多克隆抗体有良好特异性和效价,能够满足针对ALC免疫印迹和细胞内定位检测等实验要求,为深入研究ALC蛋白在盘基网柄菌多细胞发育的功能作用提供了有力工具.

盘基网柄菌尿囊酸酶基因RNA干扰载体的构建及干扰效果鉴定

为探究尿囊酸酶(allantoicase)基因在盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)发育中的作用,依据RNA干扰(RNAi)的原理和盘基网柄菌中构建RNAi载体的基本经验,扩增出尿囊酸酶基因642bp的长片段,397bp的短片段,并反向连接成含有发卡结构的寡核苷酸片段,克隆至表达载体pAct15Gal,构建了以盘基网柄菌尿囊酸酶基因为靶标的RNAi载体pAct15Gal-allCi。将此载体转染野生型KAx-3细胞,经G418筛选出阳性克隆RNAi-allc。将野生型细胞和RNAi-allc转染细胞发育20h后发现,转染细胞仅能形成类似细胞丘的小突起,不能完成完整的发育,而野生型细胞则能完成完整的发育,形成子实体。Western印迹几乎检测不到转染细胞有尿囊酸酶的免疫条带;流式细胞术检测转染细胞内尿囊酸酶的表达,发现表达率由野生型细胞的72.18%降为转染细胞的0.67%。表明本研究设计的核苷酸序列对靶标基因的表达有较明显的干扰作用,说明尿囊酸酶对盘基网柄菌细胞发育有一定的调控作用。

盘基网柄菌细胞发育中gp150分子与凋亡蛋白作用分析

用Percoll密度梯度技术分离和收集盘基网柄菌前柄和前孢子细胞,Western blot分析gp150分子和胱天蛋白酶在前孢子细胞和前柄细胞两种类型细胞中的表达情况.结果显示:只能在前柄细胞中检测到gp150蛋白条带,并随细胞发育蛋白的量逐渐增加,提示gp150蛋白的表达量与发育时间,前柄细胞分化有密切关系;在前柄细胞中能检测到31.5kD和37.5kD分子量大小的凋亡蛋白,且蛋白量也是随发育时间有所增加,在两种类型细胞中都可检测38.2kD的凋亡蛋白.这些数据表明盘基网柄菌细胞凋亡过程中有类似Caspase-3的蛋白表达,它们的存在与细胞凋亡存在密切关系;gp150分子的表达与胱天蛋白酶的激活可能存在一定关系.

混凝土裂缝产生的原因及新的控制方法

从设计和施工两方面论述了混凝土裂缝产生的原因,并提出一些新型混凝土裂缝的控制方法,以减少混凝土裂缝带来的不良影响,从而提高建筑的质量,延长建筑物的使用寿命。