C反应蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Westernblot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-CRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域。结论成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。

重组人CRP的表达纯化及其内化进入HeLa细胞的观察

目的:构建人C-反应蛋白(CRP)原核表达载体,表达纯化his-EGFP-CRP蛋白,观察其能否内化进入HeLa肿瘤细胞。方法:利用特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到原核表达载体pET14b/MCS-EGFP-(N)36上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化,梯度透析复性,并与HeLa细胞孵育,利用荧光显微镜观察其内化入胞。结果:PCR、双酶切和测序鉴定表明,pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒构建正确;转化实验发现,该质粒在BL21(DE3)中能够被大量诱导表达;蛋白纯化及荧光显微镜观察结果表明,复性后的表达产物可结合于HeLa细胞膜,孵育一定时间后,可定位于胞质及胞核。结论:成功地构建了带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人CRP原核表达载体,该载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中被诱导表达重组蛋白his-EGFP-CRP,纯化复性后的重组人CRP能与HeLa肿瘤细胞结合,并能内化入胞,移位入核。

雌二醇对三阴乳腺癌细胞integrin β4水解作用的影响

目的:研究三阴乳腺癌(TNBC)MDA-MB-231细胞中雌二醇对整合素(integrin)β4水解的促进作用。方法:常规培养MDA-MB-231细胞至指数增长期,分别给予17β-雌二醇、雌激素受体(ER)特异性阻断剂4-羟基他莫西芬(OHT)和G蛋白偶联受体30(GPR30)特异性阻断剂G-15干预30 min,采用蛋白质印迹(Western blot)实验检测钙激活中性蛋白酶2(calpain 2)的表达和integrinβ4水解的情况。结果:17β-estradiol在短时间内可促进MDA-MB-231细胞130和95k D integrinβ4水解片段的产生,促进作用呈浓度依赖方式,而对calpain 2表达没有明显影响;4-OHT不能阻断17β-estradiol对integrinβ4的水解作用,且其本身可促进integrinβ4水解;G-15能阻断17β-estradiol对integrinβ4的水解。结论:在TNBC MDA-MB-231细胞中,17β-estradiol可通过GPR30促进130和95k Dintegrinβ4水解片段的产生。

细胞培养密度对MCF7细胞calpain2和FAK的水解及活性影响

目的:探讨细胞培养密度对乳腺癌MCF7细胞钙激活中性蛋白酶2(calpain 2)和焦点黏附蛋白(FAK)的水解及活性的影响。方法:常规培养乳腺癌细胞MCF7,分别以1×106、5×106、1×107个细胞传代于不同的6 cm皿中,培养36 h后,形成不同的培养密度(分别为低密度、正常密度和高密度),裂解细胞,提取蛋白行Western blot检测calpain 2和FAK的表达,用磷酸化抗体检测FAK的Y397位点磷酸化水平;MCF7细胞高密度培养并calpain 2抑制剂处理后,用Western blot法检测FAK水解情况和磷酸化水平。结果:不同密度培养对calpain 2的表达没有明显影响,但可影响calpain 2的水解,培养密度加大,水解程度加强;培养密度也可以影响FAK的水解模式,低密度培养细胞的FAK以较大的水解片段为主,高密度培养的FAK则以较小片段为主,高密度培养细胞FAK Y397磷酸化水平比低密度的低;给予calpain 2特异性抑制剂后,高密度培养细胞FAK大片段增多,小片段减少,其Y397位点的磷酸化水平增高。结论:细胞高密度培养可使MCF7细胞calpain 2的活性增强,FAK的水解程度加大,降低FAK的磷酸化。

两种细胞系中内源性C-反应蛋白的表达和定位分析

目的观察在不同刺激条件下,不同组织来源细胞系中内源性C-反应蛋白(CRP)的表达及定位情况。方法培养人单核细胞系THP-1和人肝细胞系LO2,用佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞;使用内毒素(LPS)对两种细胞进行刺激,同时收集LPS刺激后的THP-1细胞的培养液上清加入到LO2细胞的培养液中进行孵育,运用Western blot和免疫细胞化学技术检测上述刺激条件下CRP在两种细胞中的表达及其定位情况。结果Western blot检测表明,在未受到刺激时,两种细胞的裂解物中均检测到一定量的CRP,在细胞培养液上清中没有检测到;受到LPS刺激后,THP-1细胞内的CRP表达增加,且在培养液上清中也检测到少量的CRP,但对于LO2细胞,刺激前后CRP的表达和分泌没有明显变化;当用LPS刺激后的THP-1细胞的培养液上清处理LO2细胞后,在LO2的细胞裂解物和培养液上清中均检测到CRP。免疫细胞化学检测结果显示,整个THP-1细胞中均可检测到标记的CRP的荧光信号,其中以核内的最明显,LPS刺激可以增加该蛋白的表达,使其核定位更加明显;在LO2细胞中,CRP定位于核外,LPS刺激对其表达和定位没有明显影响,而给予LPS刺激的THP-1细胞培养液上清处理后,LO2细胞中标记CRP的荧光信号增强,尤其以细胞膜上的增强明显。结论LPS不能直接上调肝细胞LO2内的CRP表达,却可以诱导THP-1表达分泌某些细胞因子来增加CRP的合成分泌;CRP在肝细胞系LO2和单核-巨噬细胞系THP-1中的定位有明显不同,在LO2中主要表现为分泌型蛋白的定位特征,而在THP-1细胞中却有明显的核定位表现。

绿色荧光标记C-反应蛋白的原核表达和毛细管电泳检测

目的:表达纯化重组的His-EGFP-CRP蛋白,通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价。方法:用pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析,获得复性的His-EGFP-CRP蛋白;并用高效毛细管电泳(HPCE)技术对复性的蛋白进行检测,了解蛋白质的等电点及活性。结果:转化实验发现,该质粒pET14b/EGFP-hCRP在BL21(DE3)中能够被诱导表达;通过包涵体变性溶解、亲和色谱纯化可获得纯度较高的His-EGFP-CRP蛋白;HPCE分离发现复性后的His-EGFP-CRP蛋白峰为多个,其在电泳液pH值低于6时易检出,His-EGFP-CRP与THP-1细胞裂解物孵育后的检测峰增多。结论:成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白His-EGFP-CRP,通过包涵体变性溶解及亲和色谱纯化获得该重组蛋白,复性后的His-EGFP-CRP等电点接近于6,以单体或多聚体等结构形式存在,具有结合活性,能与细胞内相关分子结合成复合物,可应用于CRP功能和内化机制的研究。

雌二醇通过Calpain 2有限水解integrinβ4促进乳腺癌SK-Br3细胞迁移浸润的相关机制

目的研究雌二醇通过calpain 2/integrinβ4促进人表皮生长因子受体(Her2)阳性的乳腺癌SK-Br3细胞迁移和浸润的相关机制。方法常规培养乳腺癌SK-Br3细胞,calpain 2的特异性抑制剂或雌二醇(E2)处理细胞,并对汇合度为60%(低密度)和90%(高密度)的细胞进行培养;通过细胞划痕实验检测SK-Br3细胞的迁移能力,Transwell-Matrigel实验检测SK-Br3细胞的浸润能力,免疫细胞化学技术和激光共聚焦扫描显微镜观察integrinβ4和Her2的表达与共定位,免疫共沉淀技术检测integrinβ4和Her2的相互作用,Western blot技术检测相关蛋白或蛋白片段的表达及蛋白磷酸化水平。结果划痕和浸润实验显示,相对于对照组,Calpain2抑制剂处理的SK-Br3细胞迁移和浸润能力减弱(P<0.05);免疫细胞化学成像显示,Her2和integrinβ4的共定位主要在细胞膜上,在胞浆也有少量共定位,用calpain inhibitorⅣ处理后,Her2和integrinβ4的表达减少,共定位也明显减少;免疫共沉淀实验发现,在Her2免疫沉淀物中可检测到integrinβ4,在integrinβ4免疫沉淀物中可检测到Her2;给予calpain inhibitorⅣ处理,可以减少Her2和integrinβ4之间的免疫共沉淀;Western blot检测发现,高密度培养乳腺癌SK-Br3细胞中的integrinβ4比低密度培养的水解程度高;在高密度培养条件下,E2可以促进这些integrinβ4水解片段的产生,上调calpain 2的表达,也伴随着integrinβ4水解程度的增加,同时使Src的Y418位点的磷酸化水平增高。结论高密度培养条件下,E2可通过上调和激活calpain2,促进integrinβ4的有限水解,促进integrinβ4和Her2的相互作用,磷酸化激活Src,促进SK-Br3细胞的迁移和浸润。

青藤碱及针刺治疗对海洛因戒断大鼠杏仁核的影响

目的观察和评价针刺及青藤碱(sinomenine)治疗对海洛因成瘾大鼠戒断症状及其杏仁核(amygdala)自发放电及突触素(synaptophysin)表达的影响。方法75只SD大鼠随机均分5组:对照组、成瘾组、针刺组、青藤碱组和联合治疗组。皮下注射海洛因建立成瘾模型大鼠。3个治疗组分别给予针刺穴位(内关、百会、足三里)、青藤碱肌注及两者联合治疗。评估各组大鼠诱导戒断症状,用电生理技术观察5组大鼠杏仁核自发放电,免疫组织化学技术检测杏仁核突触素表达。结果给予纳洛酮后,大鼠出现典型诱导戒断症状(P<0.01),造模成功;给予针刺及青藤碱治疗后,其戒断症状明显减轻(P<0.01)。杏仁核自发放电结果显示:相对于对照组,海洛因成瘾大鼠自发放电低频放电和单个不匀放电比例增多,束簇状和混合型放电比例明显减少(P<0.05),而给予青藤碱或联合治疗的成瘾大鼠放电形式得以逆转(P<0.05),接近对照组水平。免疫组化结果显示,相对于对照组,成瘾组大鼠杏仁核突触素表达增多(P<0.01),给予针刺、青藤碱及联合治疗的大鼠杏仁核突触素的表达明显减少(P<0.01)。结论针刺及青藤碱治疗可以减轻海洛因成瘾大鼠的戒断症状,一定程度地纠正成瘾大鼠杏仁核自发放电频率和形式的异常,降低海洛因成瘾大鼠杏仁核突触素的表达,且二者联合应用效果更好。

大鼠原代肝星状细胞活化后组蛋白修饰水平的观察

目的:观察体外培养大鼠肝星状细胞(HSCs)活化过程中组蛋白修饰的改变以及与HSCs活化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的关系,探讨组蛋白修饰在HSCs活化过程中可能的作用。方法:体外分离、鉴定、培养大鼠HSCs,光镜观察HSCs活化过程中的形态变化,细胞免疫荧光染色和Western blotting检测desmin和α-SMA的表达,比较静止型HSCs和激活型HSCs中H4K12乙酰化、H3K9乙酰化、H3K4二甲基化和H3K9二甲基化的变化。结果:(1)细胞形态学观察结果表明HSCs在培养过程中形态由静息状态向高度分化的肌成纤维细胞转化。细胞免疫荧光染色及Western blotting检测结果显示,分离培养24 h的HSCs有desmin表达,但几乎不表达α-SMA;随着培养时间延长,HSCs内α-SMA和desmin表达逐步增加,至15 d时达到最大。(2)根据HSCs细胞形态变化及HSCs活化标志蛋白检测结果,确定培养24 h的HSCs为静止型HSCs,培养15 d的HSCs为激活型HSCs,分别检测其组蛋白修饰变化。结果显示,与静止型HSCs比较,激活型HSCs中H4K12乙酰化、H3K9乙酰化和H3K9二甲基化修饰水平明显降低(P<0.01),而H3K4二甲基化修饰水平明显增加(P<0.01),且H3K4二甲基化修饰水平变化与α-SMA表达变化一致。结论:在体外培养HSCs活化过程中,组蛋白修饰发生明显异常,提示组蛋白修饰改变有可能参与了HSCs活化以及肝纤维化的发生。

慢性染砷对大鼠学习记忆功能的影响

目的:研究慢性染砷对子代大鼠水迷宫实验和海马齿状回长时程增强(LTP)的作用,探讨慢性染砷对子代大鼠学习记忆功能的影响。方法:从妊娠期前2周开始,用高、低两种剂量的含砷水给两个实验组母鼠饮用,子鼠断乳后继续饮用与其母鼠同样的砷水,对照组给予自来水饮用。子鼠染砷5个月后(从娩出后计算)通过水迷宫实验观察不同剂量染砷组及对照组子代大鼠学习记忆能力,之后进行长时程增强实验。结果:高剂量染砷(A2)组大鼠学习记忆成绩(58.83±26.13)分,低剂量(A1)组为(75.33±19.65)分,两组比较P<0.05;对照(C)组(85.33±8.85)分,A2组与C组比较P<0.01;A1组较C组差异不明显,P>0.05。三组大鼠PS潜伏期变化趋势差异不明显,P>0.05;A1组与C组EPSP斜率在5min～150min时间段内差异显著,P<0.01;A2组与C组在5min～150min时间段内差异显著,P<0.01;A2组与A1组在整个时间段内差异不明显,P>0.05;A1组与C组PS幅值在100min～150min时间段内差异明显,P<0.05;A2组与C组在20min～150min时间段内差异明显,20min～100min,P<0.05,100min～150minP<0.01;A2组与A1组在整个时间段内差异不明显,P>0.05。结论:从胚胎期慢性染砷的大鼠空间学习记忆能力下降,LTP实验发现砷可影响LTP诱导或维持的突触和突触后机制,而这可能是慢性染砷影响大鼠学习记忆能力的途径之一。

慢性染砷对大鼠大脑皮层组织细胞DNA损伤及细胞凋亡的影响

目的:通过单细胞凝胶电泳(SCGE)和免疫组织化学的方法探讨慢性染砷对大鼠大脑皮层组织细胞的影响及机制。方法:60只3周龄Wistar大鼠随机分为低剂量染砷组(A1)、高剂量染砷组(A2)和对照组(C),分别自由饮用10.0 mg/L、40.0 mg/L的三氧化二砷水溶液和自来水,喂养6个月后处死大鼠,取新鲜的大脑皮层进行SCGE实验,检测各组大脑皮层凋亡蛋白Bax的表达。结果:SCGE实验提示,染砷组大脑皮层细胞DNA损伤明显高于对照组,P<0.01。凋亡蛋白Bax在3组均有表达,随着染毒剂量的增加Bax表达增强,A2组与C组比较P<0.01。结论:慢性染砷可引起大鼠大脑皮层组织细胞DNA损伤和诱导细胞凋亡。

组蛋白乙酰化水平对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的:观察人肝细胞株LO2及不同转移能力的肝癌细胞株Hep G2、MHCC-97L和LM3中组蛋白H3K9、H4K12及H4K16位点的乙酰化水平,并探讨组蛋白乙酰化对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法:采用Western blot实验检测LO2、Hep G2、MHCC-97L和LM3中组蛋白H3K9、H4K12及H4K16乙酰化水平;应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他(SAHA,1.5μmol/L和3μmol/L)处理肝癌LM3细胞株24 h、48 h后,Western blot检测其组蛋白H3K9、H4K12及H4K16乙酰化水平变化,transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力的变化。结果:H3K9、H4K12及H4K16乙酰化水平由高到低为Hep G2、MHCC-97L、LM3,3种肝癌细胞株的乙酰化水平均低于人肝细胞LO2(P<0.05);去乙酰化酶抑制剂SAHA作用后,LM3细胞组蛋白H3K9、H4K12及H4K16乙酰化水平明显提高,细胞的迁移、侵袭能力明显降低,与未用SAHA处理的LM3细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:提高组蛋白H3K9、H4K12、H4K16位点的乙酰化水平,能抑制肝癌细胞的迁移、侵袭能力。

肥大细胞甲苯胺蓝-PAS改良染色法

肥大细胞（mast cell）是疏松结缔组织中常见的细胞,位于小血管附近,成行成群分布,胞体较大,呈圆或卵圆形,核小而圆,染色深,居中,其胞质中充满粗大的嗜碱性颗粒,有异染性,颗粒易溶于水,颗粒内含有肝素、组胺和嗜碱性粒细胞趋化因子等[1]。肥大细胞染色方法种类很多[2],常用甲苯胺蓝（tolui-dine blue）染色。

钙激活中性蛋白酶抑制剂对E2诱导的乳腺癌细胞增殖效应的影响及其意义

目的观察钙激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease,CANP)抑制剂对雌二醇(estradiol,E2)诱导的乳腺癌细胞增殖效应的影响,为探索乳腺癌治疗新药靶提供理论依据。方法以人乳腺肿瘤细胞系MCF-7为模型细胞,RPM1-1640培养,E2处理;MTT法分析细胞增殖,观察E2诱导乳腺癌细胞增殖;CANP特异性抑制剂calpeptin(CAL)或E2受体选择性调节剂他莫西芬(Tamoxifen,TAM)预处理模型细胞,观察CAL或TAM对E2诱导的肿瘤细胞增殖效应的影响及其差异。结果(1)E2诱导MCF-7细胞增殖呈时间和剂量依赖性。E2发挥最大作用的浓度为10-8mol/L,最佳作用时间为24h,增殖率达18.6%(P<0.01);(2)TAM能显著抑制E2诱导的细胞增殖,浓度为10-6mol/L时抑制效能最佳,抑制率达28.63%(P<0.01);(3)CAL也可明显抑制E2的细胞增殖效应,在CAL为10-5mol/L时抑制率最高,达26.34%(P<0.01)。比较CAL与TAM的细胞增抑制殖效能未见显著性差异。结论CANP抑制剂能有效抑制E2诱导的乳腺癌细胞增殖活动,因而以CANP作为乳腺癌治疗的候选药靶可能具有潜在的应用前景。

肝癌模型大鼠癌组织组蛋白乙酰化水平观察

目的:观察肝癌模型大鼠癌组织中组蛋白H3K9、H4K12、H4K16位点的乙酰化水平。方法:50只大鼠随机分为模型组(40只)及对照组(10只),予模型组大鼠2.5 g/L二乙基亚硝胺(DEN)溶液自由饮用14周建立肝癌模型,对照组大鼠自由饮用灭菌食用水;造模结束后,取肝组织镜下观察,确认造模成功,采用免疫组织化学及Western blot检测肝癌组织中组蛋白H3K9、H4K12及H4K16乙酰化水平。结果:造模过程中模型组大鼠死亡20只,另20只大鼠肝组织肝小叶结构破坏,假小叶形成,在11个标本中可见肝癌细胞;免疫组织化学染色及Western Blot检测结果显示,模型大鼠肝癌组织组蛋白H3K9、H4K12及H4K16位点乙酰化水平均低于对照组大鼠肝组织(P<0.05)。结论:DEN诱导的肝癌模型大鼠肝癌组织组蛋白H3K9、H4K12及H4K16位点的乙酰化水平均明显降低,提示组蛋白H3K9、H4K12、H4K16位点的低乙酰化可能参与了肝癌的发生。

独一味对内毒素血症BALB/c小鼠血清细胞因子的影响

目的检测独一味预处理对内毒素血症BALB/c小鼠血清细胞因子水平的影响,初步探讨独一味对炎症的调节机制。方法用独一味浸膏液对雄性BALB/c小鼠进行灌胃预处理,5d后给予内毒素促使内毒素血症的发生,6h后动物断头取血,制备血清样品,利用LiquiChip系统检测血清细胞因子水平。结果细胞因子检测发现,非致死性内毒素血症6h时血清细胞因子普遍增高,为正常水平的数倍到数百倍(P<0.01)。给予独一味处理可以改变内毒素血症细胞因子的血清水平,使血清MCP-1约下降20%(P<0.01),血清TNFα约下降40%(P<0.01),使血清IL-1β约上升1倍(P<0.01),血清IL-4上升了37%(P<0.01),血清IL-10约上升20%(P<0.01),独一味对血清IL-6水平没有明显影响(P>0.05)。结论独一味对内毒素血症不同细胞因子的调节不同,具有选择性和多样性。其提高了抗炎细胞因子的水平,减少了部分促炎因子的表达,避免发生过激的炎症反应,保护机体组织,且同时还提高IL-1等促炎细胞因子的表达,增强机体的天然免疫机制。

用单细胞凝胶电泳法研究慢性染砷对子代大鼠海马DNA的影响

目的:以单细胞凝胶电泳法(SCGE)研究慢性染砷对子代大鼠海马神经DNA的影响。方法:从妊娠期前2周开始,用不同剂量的含砷水和自来水分别饲种鼠及其子代大鼠。子鼠染砷7个月后(从娩出后计算)取子鼠的海马组织制备单细胞悬液,进行SCGE实验。结果:长期慢性染砷对子代大鼠海马组织DNA具有显著的损伤作用,长期高剂量染砷损伤主要以中等程度损伤为主,低剂量染砷损伤以低度损伤为主,统计分析结果提示,高染砷组相对于对照组差异显著(P<0.01)。结论:通过SCGE实验,观察到慢性染砷可引起海马组织的细胞DNA损伤或损伤易感性增加。

钙激活中性蛋白酶-2对整合素β4水解的影响

目的:观察乳腺癌细胞系MCF7细胞中,钙激活中性蛋白酶2(calpain-2)对整合素(integrin)β4水解的影响。方法:利用"短发夹"RNA(shRNA)和微小RNA(mirRNA)技术结合的calpain-2基因沉默(gene silencing)慢病毒质粒(GIPZ lentiviral shRNAmir)转染乳腺癌细胞株MCF7,嘌呤霉素筛选稳定沉默calpain-2基因的细胞株,细胞株传4代,用荧光显微镜观察转染效率,用蛋白质印迹(Western blot)实验检测calpain-2基因沉默效率及integrinβ4水解的情况。结果:嘌呤霉素筛选、细胞传4代,荧光显微镜下观察显示转染和筛选后,EGFP表达阳性的MCF7细胞的比例分别达到(95.6±2.6)%(空shRNAmir载体)、(97.1±1.7)%(Calpain-2 shRNAmir1)和(97.7±0.2)%(Calpain-2 shRNAmir 2),差异无统计学意义(P>0.05);Western blot结果显示,基因沉默的MCF7细胞中calpain-2的表达被明显抑制,相对于空shRNAmir载体转染的MCF7细胞,差异有统计学意义(P<0.01),calpain-2的表达下调到21.5%(Calpain-2 shRNAmir 1)和18.8%(Calpain-2 shRNAmir 2),空shRNAmir载体转染的MCF7细胞中calpain-2的表达与未转染的MCF7细胞比较,差异无统计学意义(P>0.05);比较calpain-2基因沉默和空shRNAmir载体转染的MCF7细胞,发现integrinβ4均被水解,水解片段的分子量主要有200 k D、130和95 k D;calpain-2基因沉默后,calpain-2基因沉默MCF7细胞中200 k D的水解片段比空shRNAmir载体转染的MCF7细胞减少(P<0.01)。结论:在乳腺癌细胞MCF7中,calpain-2可能参与integrinβ4的200 k D片段的形成,从而参与调整integrinβ4的构象变化。

钙激活中性蛋白酶-2对肝癌细胞阿霉素耐药性的影响

目的观察阿霉素作用下,钙激活中性蛋白酶-2(cal-pain-2)在肝癌细胞(HepG2)中的表达及其对细胞存活率的影响,评价其作为抗癌药靶的可能性。方法以倍比稀释的ADM作用于HepG2细胞,用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)实验检测阿霉素(Adriamycin,ADM)72 h的半数致死量(LD50);用蛋白质印迹(Western blot)检测的ADM(LD50)作用下,calpain-2和cyclin E的表达和酶解情况;给予calpain-2抑制剂(calpastatin peptide)干预后,用MTT法观察ADM对HepG2细胞存活率的影响。结果 MTT实验结果显示,ADM对HepG2的LD50为2.5μmol.L-1;Western blot发现,随ADM作用时间的延长,calpain-2的表达水平增高(P<0.01),而且被剪切的程度增加(P<0.05);MTT检测ADM对HepG2的作用发现,calpastatin peptide干预的细胞存活率明显低于对照组(P<0.01),Cyclin E被剪切的程度减轻(P<0.01)。结论肝癌细胞HepG2在ADM作用下发生凋亡的同时,也上调calpain-2的表达水平和活性,并通过其信号通路降低对ADM的敏感性,而针对calpain-2的活性抑制可以提高HepG2对ADM敏感性,提示calpain-2可以作为降低肿瘤化疗耐药性的潜在靶点。

慢性染砷对大鼠肾脏DNA损伤的影响

目的本实验通过用单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)实验方法探讨慢性染砷对大鼠肾脏组织细胞DNA的影响及其可能机制。方法60只3周龄Wistar大鼠随机分为低剂量染砷组(A1)、高剂量染砷组(A2)和对照组(C),分别自由饮用10.0mg/L、40.0mg/L的三氧化二砷水溶液和自来水,喂养6个月后,处死大鼠,取新鲜的肾脏组织进行SCGE实验。结果染砷组肾脏组织细胞DNA损伤明显高于对照组,A2、A1组与对照组比较,P<0.01。结论慢性染砷可引起大鼠肾脏组织细胞DNA的损伤。