利用pHDE-Cas9构建巨桉CTX基因家族CRISPR载体

【目的】利用高效基因编辑系统(p HDE-Cas9)构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX)基因家族规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)载体,为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础。【方法】设计巨桉CTX基因靶位点和引物,扩增p CBC质粒上的目的片段,BsaⅠ酶切p HDE载体并与目的片段连接形成重组质粒,转化DH5α感受态细胞。提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证,挑选阳性克隆质粒进行测序分析,构建CTX基因家族CRISPR载体。【结果】重组质粒PCR鉴定及测序结果表明,重组载体序列无突变,与预期序列高度一致。成功构建了巨桉CTX基因家族p HDE-CTXA、p HDE-CTXB和p HDE-CTXC同源表达载体。【结论】利用p HDE-Cas9成功构建了巨桉CTX基因家族CRISPR载体,构建过程快速、高效,为桉树基因组定点编辑打下了基础,也可为其他桉树CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴。

一种拟南芥基因高效编辑体系研究

CRISPR/Cas9基因编辑系统操作简单易行,无需引入外源基因,生物安全性高。但怎样快速筛选获得不含外源转化元件的基因编辑后代是一个关键技术问题。本研究创造性的将拟南芥种皮特异性启动子At2S3与荧光筛选标记基因mCherry组装进植物基因组定点编辑CRISPR载体pHDE中,以拟南芥as1为靶基因,构建一种通过荧光标记筛选、实现转化后代中Cas9 Free的基因高效编辑体系。结果表明,通过同源重组方法构建的带有筛选标记的CRISPR载体与设计相符,外源插入片段正确。挑选转化后种皮上带有红色荧光标记的阳性种子培育得到T 1代植株,经PCR验证,成功获得as1定点敲除的纯合突变植株,纯合子比率达到40%;挑选T 1代纯合突变上不带荧光的种子,培育得到的T 2代植株中,PCR检测不到Cas9片段,实现了编辑后代的Cas9 Free。本研究构建的一种带有可视化筛选标记的基因高效编辑体系,成功实现编辑后代中无外源插入的Cas9等转化元件,生物安全性高,为基因组定点编辑技术在植物遗传资源改良中的高效利用提供了借鉴与参考。

基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T1不含荧光的种子进行培育得到的T2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。