HSP70-TKD诱导的NK细胞杀伤肝癌细胞的实验研究

目的:探讨从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中获得足够数量和高细胞毒活性的CD3-CD56+NK细胞的方法,并观察其对肝癌细胞HepG2杀伤效应。方法:以干细胞培养基(SCGM)为基础培养基,在不同浓度的抗CD3单抗、IL-2和PHA的培养条件下,从健康人PBMC中高效扩增获得CD3-CD56+NK细胞;以不同剂量的HSP70-TKD诱导NK细胞的活性,MTT法测定HSP70-TKD诱导的NK细胞对HepG2和榄香烯处理的HepG2细胞的杀伤活性。结果:建立了从人PBMC体外扩增CD3-CD56+NK细胞体系:以SCGM为基础培养基,在600U/mLIL-2、500μg/L抗CD3单抗和50mg/LPHA联合作用下,培养14d细胞扩增了116倍,含有(66.97±8.76)%CD3-CD56+NK细胞;HSP70-TKD诱导的NK细胞对HepG2杀伤活性低,与未经TKD诱导的NK细胞之间差异无统计学意义,P=0.298;而对榄香烯处理过的HepG2杀伤活性高,诱导组与未诱导组之间差异有统计学意义,P=0.008;当TKD浓度为2.0mg/L时,杀伤活性最高为(58.8±3.4)%。结论:以干细胞生长培养基为基础培养基,在抗CD3单抗和IL-2协同刺激下体外大量扩增NK细胞,HSP70-TKD诱导的NK细胞对细胞膜HSP70阳性的肿瘤细胞杀伤活性高,而对于细胞膜HSP70低表达的肿瘤细胞杀伤活性低。

草栽与木栽灵芝营养成分的比较分析

分析比较了象草 (Pennisetum purpureum )栽培灵芝与椴树 (Tiliatuan)段木栽培灵芝的氨基酸、脂肪酸、微量元素含量。结果表明 ,象草栽培灵芝的营养成分接近甚至略高于段木培养的灵芝。

HSP70-TKD诱导的NK细胞对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究HSP70-TKD诱导的自然杀伤细胞(NK)对胰腺癌原位移植模型的体内抗肿瘤作用。方法:用干细胞培养基富集人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)至第10天时,加入2μg/ml TKD,4 d后用流式细胞仪检测诱导后NK细胞表面杀伤性受体CD94/NKG2C的表达情况,MTT法测定诱导后NK细胞体外对细胞表面HSP70表达阳性的胰腺癌Colo357细胞的杀伤活性。在BALB/c裸鼠胰腺原位接种胰腺癌Colo357细胞至第15天时,尾静脉注射HSP70-TKD诱导的NK细胞,观察NK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用。免疫组化染色检测NK细胞在胰腺癌组织的浸润情况。结果:NK细胞在干细胞培养基中可大量增殖,14 d时平均细胞纯度为(87.50±1.35)%。HSP70-TKD诱导的NK细胞其细胞表面CD94/NKG2C的表达明显增加,其平均荧光强度为(220.56±6.82),高于未诱导组的(68.72±1.85)。HSP70-TKD诱导的NK细胞对胰腺癌细胞Colo357有更强的杀伤活性,当效靶比为40∶1时杀伤率高达(68.72±2.55)%。体内实验表明,TKD诱导的NK细胞能显著抑制胰腺癌的生长,其抑瘤率可达(61.3±1.5)%,与对照组差异显著(P<0.01)。免疫组化染色表明IL-2和TKD同时诱导的NK细胞更易向胰腺癌组织浸润。结论:HSP70-TKD诱导的NK细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞,具有较强的体外抗细胞表面HSP70表达阳性的胰腺癌细胞活性,具有明显的抑制胰腺肿瘤生长的作用。

枯草芽孢杆菌ATCC2233产生表面活性素的研究

薄层层析定性分析结果表明枯草芽孢杆菌ATCC2 2 33能够产生Surfactin ,生长曲线表明菌体生长和产Surfactin的过程不同步。透明圈测定结果表明产Surfactin的最适温度为 37℃ ,最适pH为 7 0。Surfactin能够显著降低水 -空气之间的表面张力。

Flt3配体联合IL-15诱导小鼠脾脏NKDC功能的实验研究

目的探讨Flt3配体联合IL-15提高小鼠脾脏自然杀伤性树突细胞(natural killer dendritic cell,NKDC)杀伤肿瘤细胞的活性和增强刺激小鼠T细胞增殖的功能。方法将C57BL/6小鼠分为4组:A组不予任何因子处理,B组腹腔注射小鼠重组F1t3配体(100 ng/只),C组腹腔注射小鼠IL-15(500 ng/只),D组同时腹腔注射F1t3配体(100 ng/只)和IL-15(500 ng/只)。分别检测不同处理组小鼠脾脏NKDC杀伤小鼠淋巴瘤Yac-1细胞的活性、刺激小鼠T细胞增殖的功能及培养上清液中IFN-γ的分泌。结果在单独F1t3配体或单独IL-15作用下,NKDC杀伤小鼠淋巴瘤Yac-1细胞的活性与对照组比较差异无统计学意义(65.7%、66.5%vs 65.0%,P=0.12、P=0.13),与对照组比较,F1t3配体联合IL-15显著提高NKDC杀伤小鼠淋巴瘤Yac-1细胞的活性(78.8%,P=0.03);F1t3配体作用下NKDC刺激T细胞活性增强(为对照组的1.6倍),而在IL-15作用下,刺激T细胞活性降低(仅为对照组的0.8倍)。在F1t3配体和IL-15联合作用下,其刺激T细胞活性较对照组高(为对照组的1.5倍),略低于F1t3配体的作用。F1t3配体单独作用下,细胞上清IFN-γ为(97.0±0.5)μg/L,与对照组(98.5±1.2)μg/L比较差异无统计学意义(P>0.05),而在IL-15作用下或在F1t3配体和IL-15联合作用下,其IFN-γ分泌均有显著提高,在IL-15作用下,其IFN-γ分泌为(980±3.2)μg/L,而在F1t3配体和IL-15联合作用下,IFN-γ分泌为(991±2.5)μg/L,与对照组比较,差异均有统计学意义(P=0.008,P=0.007)。结论 F1t3配体联合IL-15可增强NKDC细胞的杀伤活性和刺激T细胞增殖的功能及增加NKDC培养上清中IFN-γ的分泌。

小鼠脾脏自然杀伤性树突细胞纯化方法的比较

目的比较流式细胞分选技术(FACS)及免疫磁珠分选技术(MACS)对小鼠脾脏自然杀伤性树突细胞NKDC分选纯化的效率,为自然杀伤性树突细胞的深入研究创造基本条件。方法 制备小鼠脾脏单细胞悬液,细胞悬液经70μm细胞滤膜过滤,离心滤液,用红细胞裂解液裂解沉淀中的红细胞,用缓冲液洗涤两次后通过FACS和MACS分选方法各自分选其脾脏表型为NK1.1+CD11c+的自然杀伤性树突细胞NKDC。结果 分选之前小鼠脾脏NK1.1+CD11c+自然杀伤性树突细胞占3.3%。单细胞悬液经FACS分选的NKDC纯度为(90.2±2.0)%,回收率为(91.3±1.8)%,细胞活力(82.5±1.2)%;经MACS分选纯度为(70.5±3.0)%,回收率为(80.5±1.7)%,细胞活力为(60.2±0.8)%。两种方法分选NKDC细胞纯度差异有统计学意义(P=0.03),回收率差异也有统计学意义(P=0.02)。结论 FACS较MACS可更高效、快捷、简便地纯化小鼠脾脏自然杀伤性树突细胞。

人癌胚抗原cDNA的克隆与真核表达质粒的构建

[目的]将人癌胚抗原(CEA)cDNA克隆到真核表达载体pIRES中,构建真核表达质粒pIRES鄄CEA,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达,并为下一步连接上热休克蛋白基因(HSP70)从而构建CEA鄄HSP融合核酸疫苗作准备。[方法]从CEA阳性的大肠癌组织中提取总RNA,经RT鄄PCR方法获取人癌胚抗原cDNA,用内切酶XbaⅠ和NotⅠ分别酶切质粒pIRES和CEAcDNA,通过T4连接酶将带有黏性末端的CEA鄄cDNA插入到pIRES质粒的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点上。[结果]通过PCR扩增获得了CEA基因,并将CEA鄄cDNA正向克隆到载体pIRES中。[结论]已经成功构建了真核表达质粒pIRES鄄CEA,并为下一步连接上热休克蛋白基因(HSP70)从而构建CEA鄄HSP融合核酸疫苗作准备。

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人粒细胞 巨噬细胞集落刺 激因子(GM CSF)基因的重组腺病毒载体,为进 一步研究GM CSF基因在肿瘤基因治疗中的应 用提供实验基础。方法:采用PCR方法,从重 组质粒pcDNA3.1 GM CSF扩增出GM CSF 基因片段,通过穿梭质粒pShuttle,将带有CMV 启动子的目的片段克隆入Adeno X腺病毒 DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转 染HEK293细胞,经包装扩增后,获得重组腺 病毒Adeno X GM CSF,PCR鉴定,ELISA法 检测表达产物。结果:含GM CSF基因的重组 腺病毒Adeno X GM CSF构建成功,经PCR鉴 定和DNA测序等证实了其正确性,重组腺病毒 上清液中GM CSF表达量达26ng/mL。结论: 含GM CSF基因的重组腺病毒构建成功。

GM-CSF重组腺病毒转染外周血树突状细胞的研究

目的:利用GMCSF重组腺病毒转染外周血单核细胞,诱导培养树突状细胞(dendriticcell,DC),并与细胞因子培养的DC进行生物学特性的比较。方法:将GMCSF重组腺病毒转染正常人外周血单核细胞,或用重组细胞因子GMCSF,诱导培养获得DC,通过相差显微镜观察DC表面形态变化,FACS分析GMCSF基因转染对DC表面免疫分子表达的影响,Westernblot鉴定GMCSF的表达,ELISA检测IL12分泌水平,MTT法检测DC激发同种异体T细胞增殖的能力。结果:GMCSF重组腺病毒转染外周血单核细胞,能扩增获得DC,该DC高表达CD1a、HLADR、CD80和CD86等免疫分子,并表达细胞因子GMCSF和IL12,对同种异体淋巴细胞有更强的刺激活性。结论:用GMCSF重组腺病毒可从外周血单核细胞中扩增到DC,为DC瘤苗临床应用提供实验基础。

小鼠肠癌HSP70多肽复合物的纯化及其抗肿瘤免疫效应

目的:应用AKTA-purifier100液相层析系统,建立分离和纯化热休克蛋白70(HSP70)多肽复合物的方法,并观察其抗肿瘤免疫保护效应。方法:采用DE-AE-Sepharose离子交换层析和ADP-Ag-arose亲和层析,从热处理的BALB/c鼠源性结肠癌细胞(CT26)制备裂解液中分离、纯化HSP70多肽复合物,并通过主动免疫保护实验观察其抗肿瘤免疫效应。结果:纯化蛋白经鉴定为相对分子质量70×103左右的HSP70多肽复合物;平均1g湿重肿瘤细胞可获得63.63μgHSP70多肽复合物;HSP70主动免疫的小鼠可抵抗CT26细胞的攻击。结论:用此层析法可分离纯度较高的HSP70,并可诱导明显的抗肿瘤免疫保护效应。

HSP70-TKD诱导的NK细胞向肿瘤细胞迁移的实验研究

目的:研究HSP70-TKD诱导的自然杀伤细胞(NK)体外对细胞表面HSP70表达不同的胰腺癌细胞和结肠癌细胞的迁移作用差异。方法:用干细胞培养基富集人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)至第10天加入2μg/ml TKD,4 d后用流式细胞仪检测NK细胞表面杀伤性受体CD94/NKG2C的表达情况;应用流式分选将胰腺癌细胞系Colo357和结肠癌细胞系CW2分为HSP70高表达细胞亚系Colo+、CW2+和HSP70低表达细胞亚系Colo-、CW2-;Transwell小室实验检测HSP70-TKD诱导的NK细胞对这4种细胞的迁移能力,MTT法检测HSP70-TKD诱导的NK细胞对这4种细胞的杀伤活性。结果:流式结果显示NK细胞在干细胞培养基中培养14天可大量增殖,细胞纯度最高达(92.50±1.25)%;经HSP70-TKD诱导后,NK细胞表面杀伤性受体CD94/NKG2C的表达明显增加;经流式分选后,Colo+、Colo-细胞表面HSP70的表达分别为(78.2±2.2)%和(27.3±1.2)%,而CW2+、CW2-细胞表面HSP70的表达分别为(91.1±2.5)%和(18.2±1.0)%;HSP70-TKD诱导的NK细胞对Colo+迁移率为(68.6±2.8)%,明显高于对Colo-的迁移率(22.8±1.5)%,NK细胞对CW+迁移率为(73.5±2.7)%,明显高于对CW2-的迁移率(18.2±1.3)%;HSP70-TKD诱导的NK细胞对Colo+、Colo-的杀伤活性有显著性差异,当效靶比为20∶1时,杀伤活性分别为(61.2±3.0)%、(24.5±1.5)%,NK对CW2+、CW2-的杀伤活性有显著性差异,当效靶比为20∶1时,杀伤活性分别为(63.8±3.2)%、(22.4±1.8)%。结论:HSP70-TKD诱导的NK细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞,在体外易向HSP70表达阳性的肿瘤细胞迁移。

热休克肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞对结肠癌小鼠的治疗作用

背景与目的:目前通过树突状细胞诱导机体抗肿瘤免疫已经成为肿瘤免疫治疗的一种重要途径,热休克处理肿瘤细胞可提高肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞分化成熟,增强其体内抗肿瘤作用。本实验研究热休克肿瘤细胞抗原负载的骨髓来源的树突状细胞(dendritic cell,DC)对结肠癌小鼠的治疗作用。方法:20只小鼠随分为4组,将小鼠结肠癌细胞CT26热休克处理后超声破膜,以其细胞裂解液负载BALB/c小鼠骨髓来源的DC,观察DC诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)杀伤活性;并将DC接种于荷瘤小鼠皮下,观察其对肿瘤生长的抑制作用及对荷瘤小鼠生存期的影响。结果:与冻融抗原-DC组、DC组、PBS组相比,热休克抗原-DC诱导的CTL对CT26肿瘤细胞具有显著的杀伤作用,相同效靶比(P=0.00)下其肿瘤特异性细胞毒活性强于前者{(0.99±0.19)g vs.[(1.27±0.28)g、(2.19±0.35)g、(2.14±0.27)g],P均=0.00};用其进行免疫后对小鼠肿瘤的生长具有显著的抑制作用[(128±18)mm3vs.(313±52)mm3,P=0.04],并能显著延长荷瘤小鼠的生存时间{(57±7)d vs.[(40±3)d、(25±3)d、(24±3)d],P均=0.00}。结论:热休克肿瘤细胞抗原负载的树突状细胞对结肠癌小鼠具有显著的治疗效果。

人肺腺癌细胞系SPC-A1 mRNA修饰的树突状细胞体外抗肿瘤免疫反应

目的探讨人肺腺癌细胞系SPC-A1mRNA转染的人外周血树突细胞(dendriticcell,DC)疫苗在体外诱导特异性抗肿瘤免疫反应的能力。方法从健康人外周血分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC),在白细胞介素-4(interleu-kin-4,IL-4)和人粒细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,GM-CSF)作用下诱导培养成DC。体外扩增、转录的方法获得人肺腺癌细胞系SPC-A1mRNA,并利用脂质体转染的方法导入DC,流式检测转染后DC表面标记,并与淋巴细胞共孵育,激活T淋巴细胞,MTT法检测其对人肺腺癌细胞的特异性杀伤活性。结果转染后的DC特异性表面标志及功能相关分子表达显著升高(CD8680·32±1·60;HLA-DR86·03±2·58;CD8326·97±1·62),诱导的特异性杀伤反应能力与经肿瘤细胞裂解物负载的DC、未经转染的DC及空白淋巴细胞组相比显著提高(80·34±2·71,P<0·01)。结论人肺腺癌细胞系SPC-A1mRNA转染的DC疫苗体外诱导的特异性抗肿瘤免疫能力显著增强。

RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达

目的构建含表皮生长因子受体2基因(HER2)的短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒,体外观察对人乳腺癌细胞SKBr3的HER2 mRNA及蛋白表达的影响。方法利用分子克隆技术,将含HER2的双链DNA,与经双酶切后的载体pSilencer连接,构建pSilencer-HER2重组质粒,在脂质体的介导下转染高表达HER2的乳腺癌细胞系SKBr3。RT-PCR分析HER2 mRNA的表达,Western blot检测蛋白的表达,MTT法测定细胞增殖情况。结果酶切鉴定证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制HER2 mRNA及蛋白的表达,抑制细胞的增殖。结论构建的pSilencer-HER2重组质粒能有效地降低人乳腺癌细胞HER2的表达,抑制细胞的增殖,为HER2高表达预后不良的乳腺癌基因治疗提供新策略。

树突状细胞对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究

目的:研究人外周血树突细胞(dendriticcell,DC)对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞的影响,以期获得具有抗原特异性杀伤功能的细胞毒活性细胞,并分别对CIK、LAK和CD3AK的杀伤效果进行比较。方法:采用某一肺腺癌肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNC),经体外诱导分别扩增出CIK、LAK、CD3AK和DC细胞,再将靶细胞抗原孵育过的DC同三种细胞共同培养,通过镜下动态观察CIK联合DC对癌性胸腔积液中肿瘤细胞的杀伤活性,并利用MTT法检测CIK联合DC体外杀伤人肺腺癌细胞系(SPC-A1)的活性,同时比较CIK、LAK和CD3AK三种细胞的体外杀瘤活性。结果:CIK-A-DC的杀伤活性最强为92.3%,明显高于单纯CIK的59.7%和DC-CIK的79.8%,(P值分别为0.025和0.042),提示CIK-A-DC细胞对肿瘤杀伤的特异性。而DC-CIK的杀伤活性为79.8%,也高于单纯CIK对照组59.7%,P=0.034,说明DC具有明显增强CIK细胞杀瘤活性的功能。同时,不论从单纯CIK、LAK、CD3AK细胞毒活性,或是从三种细胞联合DC的细胞毒活性比较,CIK细胞较后两种细胞都具有更强的杀伤活性,P值分别为0.038和0.022。联合DC的自体CIK细胞体外杀瘤活性显著增强,CIK细胞的杀伤活性显著高于LAK、CD3AK两种细胞。结论:DC可明显提高自体CIK细胞的体外杀瘤活性。

真核双表达载体pIRES-CEA-HSP70的构建与鉴定

目的构建癌胚抗原(CEA)与热休克蛋白70(HSP70)的真核双表达质粒,并检测其在体外的表达。方法从结肠癌及正常肝组织中经RTPCR扩增获得CEA及HSP70cDNA,并将其定向克隆至真核双表达质粒pIRES中,重组质粒pIRESCEA及pIRESCEAHSP70,经酶切及测序鉴定后,分别转染仓鼠卵巢细胞(CHO);经RTPCR及ELISA法检测,CEA和HSP70在CHO细胞中得到有效表达。结果真核双表达载体pIRESCEAHSP70构建成功且CEA和HSP70在CHO细胞中得到有效表达。结论真核表达载体pIRESCEAHSP70的成功构建为治疗CEA阳性肿瘤提供一定的实验基础。

pIRES-CEA-HSP70核酸疫苗诱导杀伤结肠癌细胞的研究

目的:观察核酸疫苗pIRES-CEA-HSP70诱导小鼠产生的细胞免疫应答,以探索结肠癌术后复发的防治新途径。方法:将pIRES、pIRES-CEA、pIRES-HSP70、pIRES-CEA-HSP70制作核酸疫苗免疫小鼠,采用MTT比色法,检测小鼠脾淋巴细胞对结肠癌细胞CW-2的杀伤效应。结果:核酸疫苗pIRES-CEA-HSP70免疫组的小鼠脾淋巴细胞,在效靶比50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1下,对CW-2的杀伤率分别为(35.43±3.88)%(、26.88±3.17)%(、20.33±1.92)%(、15.55±0.76)%,均明显高于其余3组,差异有统计学显著性(P<0.01)。pIRES、pIRES-CEA、pIRES-HSP70 3组杀伤率差异无显著性(P>0.05)。结论:核酸疫苗pIRES-CEA-HSP70可诱导小鼠产生特异性细胞免疫应答,为其用于结肠癌的治疗提供实验基础。

RT-PCR法定量检测恶性淋巴瘤多药耐药基因的表达

[目的]应用逆转录鄄聚合酶链反应(RT鄄PCR)方法检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者多药耐药基因表达情况,以探讨NHL患者的抗药性与临床化疗的关系。[方法]对30例淋巴瘤患者采用RT鄄PCR技术检测多药耐药基因(MDR)表达情况。[结果]30例患者MDR1阳性表达13例,这13例MDR1阳性的淋巴瘤患者,没有1例经1个疗程化疗即能完全缓解。[结论]RT鄄PCR是一种敏感性高、特异性强,可定量检测MDR1表达。MDR1表达可作为一个临床化疗耐药指标,有助于淋巴瘤患者个体化疗方案制定。

外源性骨桥蛋白对人大肠癌LS-174T细胞增殖和侵袭能力的影响

目的观察人重组骨桥蛋白(recombinated human osteopontin,rhOPN)对大肠癌LS-174T细胞增殖、侵袭及其相关基因表达的影响,探讨骨桥蛋白在大肠癌演进中的作用。方法添加不同浓度rhOPN于人大肠癌LS-174T细胞培养液中,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)试验检测细胞的增殖能力,重组人工基底膜实验评价细胞侵袭能力,并运用实时荧光定量RT-PCR检测大肠癌细胞中尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)等mRNA表达水平。结果LS-174T细胞经不同浓度rhOPN作用24h后,实验组的MTT值显著高于对照组(P<0.01),并呈剂量依赖关系。Transwell上室加入5nmol/L、30nmol/L的rhOPN后,实验组LS-174T细胞穿膜数量明显多于对照组(P<0.05)。经5nmol/L、30nmol/L的rhOPN处理24h后,实验组LS-174T细胞的uPA mRNA及VEGF mRNA的表达水平明显高于对照组(P<0.05),而MMP-2 mRNA表达水平与对照组无显著性差别(P>0.05)。结论rhOPN促进人大肠癌LS-174T细胞的增殖,并提高其侵袭能力,可能与uPA和VEGF基因表达上调有关。

GM-CSF/IL1-5融合基因原核表达载体的构建及表达

目的构建原核表达质粒pPROEXTMHTbGMCSF/IL15并在大肠杆菌DH5α中表达,以期获得具有GMCSF/IL15双重活性的融合蛋白。方法利用分子生物工程技术,构建重组原核表达载体pPROEXTMHTbGM15,并转化进大肠杆菌DH5αIPTG诱导表达4h后,经SDSPAGE、免疫印迹证实为GM15融合蛋白。结果重组载体经转化大肠杆菌DH5α后,诱导表达出相对分子质量约为33kD左右的融合蛋白。结论构建了pPROEXTMHTbGMCSF/IL15融合基因表达系统,并诱导表达出GM15融合蛋白。