肿瘤坏死因子α的单核苷酸多态性与中国汉族人强直性脊柱炎的关联分析

目的 :在中国汉族强直性脊柱炎 (AS)患者中 ,检测 TNF- α基因中的单核苷酸多态性 (SNPs)。 方法 :在 1 0 7例 AS患者和 1 1 6名正常对照中 ,用直接测序法和实时动态荧光 PCR结合等位基因特异扩增 ,对 TNF- α基因中的 3个启动子上的 SNPs(- 1 0 31 T/ C,- 86 3C/ A,- 85 7C/ T)和 2个内含子上的 SNPs(内含子 1的 +1 2 3C/ T和内含子 3的 +5 1 A/ G)进行基因分型 ,分析单个位点的等位基因和基因型频率是否与 AS相关。用单倍型推测软件计算上述位点单倍体型频率的分布 ,分析这些单倍体型是否与 AS的发病有关。 结果 :在 AS患者中 ,TNF- α的 - 85 7T和 - 86 3A的等位基因频率及它们的基因型频率显著性地超过健康对照组 ,经 Bonferroni校正后仍为阳性。对启动子上 3个 SNPs位点的两两和 3个位点组合的单倍体型频率分析表明 ,其在 AS患者和对照组中也均存在极其显著的差异 (P<0 .0 1 )。在 3个位点推测的单倍体型中 ,AS患者增加最显著的是TNF- 1 0 31 T/- 86 3C/- 857T单倍体型。 结论 :TNF-α基因上 2个 SNPs及单倍体型与中国汉族

强直性脊柱炎易感基因的研究进展

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种常见的高度遗传的风湿类疾病。至20世纪70年代以来,越来越多的证据表明HLA-B27是AS最主要的易感基因。然而,全基因组扫描和关联分析等研究发现在HLA以外的区域仍存在AS的易感区域,大量的证据显示在HLA区内外有许多基因与AS的发病有关。文章主要综述了与AS相关的易感基因以及它们的研究现状。

猪囊尾蚴抗原cC1在大肠杆菌中的克隆及高效表达

[目的 ]在大肠杆菌中克隆及高效表达猪囊尾蚴抗原cC1。 [方法 ]将cC1cDNA片段以BamHI和PstI克隆到pGEM 3Z载体 ,改换限制性内切酶位点成BamHI和PstI,加上人工接头PstI BamHI XhoI后 ,克隆到pGEX 5T ,构建重组原核表达载体pGE X5T cC1。 [结果 ]培养 3h、IPTG诱导 6h ,cC1表达量最高 ,表达量占细菌总量的 5 7% ,Westernblotting结果表明猪囊尾蚴抗原cC1蛋白与囊尾蚴病猪血清有特异性的结合条带。 [结论 ]猪囊尾蚴抗原cC1在大肠杆菌中获得高效表达。

寄生虫的核酸疫苗研究

所谓核酸疫苗，就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒ＤＮＡ直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。核酸疫苗具有突出的优点：（１）能诱导全方位的免疫应答，优于亚单位疫苗和灭活疫苗，既可产...

单核苷酸多态性在复杂性状疾病易感基因研究中的应用

大多数常见病都是一些复杂性状的遗传病 ,致病机制是由多个遗传易感基因与环境因素相互作用所致。目前认为一些常见的遗传变异 ,主要是指单核苷酸多态性 (single nucleotide polym orphisms,SNPs)与复杂性状疾病的易感有关。本文在以下几个方面对 SNPs与复杂性状疾病易感基因研究的策略和方法学问题作了较为详细的综述 :(1 ) SNP特点及其有关网上资源 ;(2 )对直接测序法、单碱基延伸法、Taq Man法、基于实时动态荧光 (动力学 ) PCR的等位基因特异扩增法 ,变性高效液相色谱 (DHPL C)法和 OL A/ PCR的 SNPs基因分型方法的原理、通量和优缺点进行了比较 ;(3)

乙肝核心抗原DNA疫苗的构建及其免疫原性分析

目的 :构建 HBV核心抗原 DNA疫苗 ,并探讨其在实验动物体内的表达及其免疫原性。方法 :采用 PCR法从 HBV全基因 DNA中获得核心抗原 DNA片段 ,并将其重组到 pc DNA3载体。以此为候选疫苗分别免疫小鼠和树 ,并检测其抗HBc Ig G。结果 :构建了乙肝核心抗原候选核酸疫苗 pc DNA3- HBc。免疫接种该疫苗后第 2周抗 HBc Ig G水平开始升高 ,小鼠至第 9周 ,树至第 7周升至峰值。结论 :构建的 pc DNA3- HBc

囊尾蚴RNA的提取及体外无细胞翻译

猪带绦虫囊虫病(Taenia solium cys-ticercosis)是世界上重要的人畜共患病之一,在我国有着广泛的流域区域。它不仅危害着人类的健康,同时也给养猪业造成巨大的经济损失。由于囊尾蚴病临床症状复杂多样,易和其他神级系统疾病混淆而误诊,虽然CT技术对其诊断很有帮助,但大都为提示性、非确定性的,且费用昂贵。免疫学诊断技术对病人脑脊液(CSF)、血清或唾液进行猪囊尾蚴的特异性抗体或抗原检测是一种行之有效的方法。

囊虫病诊断用抗原编码cDNA的分子克隆

目的 :克隆与分析囊虫病诊断用抗原及其编码基因。方法 :采用基因重组技术 ,构建来源于猪囊尾蚴 m RNA的 c DNA文库。以囊虫病患者、囊虫病病猪的血清为探针从 c DNA文库中筛选出目的克隆。结果 :获得人、猪共同抗原 2个 (分子量分别为 2 8k Da和 18k Da) ,人特异性抗原和猪特异性抗原各 1个 (分子量为 34 k Da、 14k Da)。这些抗原的编码克隆分别命名为λc C1、λc C2、λc H1及 λc P1。c C1c DNA含有编码 2 8k Da的人、猪共同抗原的完整基因 ,全长 10 70 bp,起始密码 ( ATG)从自 2 2 bp,终止密码 ( TGA)结于 74 7bp,长为 74 7bp的开放阅读框架编码由 2 4 9个氨基酸组成的多肽 ,其理论推导分子量为 2 7.36k Da。结论 :以 c C1等融合蛋白为诊断用抗原 ,具有高度的特异性和较理想的敏感性。

猪囊尾蚴抗原cC1 DNA疫苗和蛋白质疫苗联合诱导小鼠免疫应答

目的 :观察 c C1 DNA疫苗和蛋白质疫苗联合免疫对诱导 BAL B/ c小鼠免疫应答的影响。 方法 :雌性 BAL B/ c小鼠随机分为 4组 :A组 (DNA疫苗组 ) ,质粒 DNA以 1 0 d间隔免疫 3次 ;B组 (联合免疫组 ) ,质粒 DNA以 1 0 d间隔免疫 2次后以 GST- c C1融合蛋白加强免疫 1次 ;C组 (蛋白质疫苗组 ) ,分别在第 0、3周免疫接种融合蛋白 ;D组 (pc DNA3对照组 ) ,以 1 0d间隔 ,3次免疫接种质粒 pc DNA3。 EL ISA法检测血清样品中的特异性抗体水平以及实验小鼠脾脏淋巴细胞分泌 IFN- γ和IL- 4水平 ,以 MTT法行脾脏淋巴细胞增殖实验。 结果 :C组可诱导相对较强的小鼠免疫应答 ,其特异性 Ig G和 Ig G1以及脾脏淋巴细胞分泌 IL- 4水平均高于其他各组 (P<0 .0 5 ) ,免疫的类型以 Th2应答为主。B组诱导的特异性抗体水平和淋巴细胞分泌细胞因子水平均明显高于 A组 (P<0 .0 5 ) ,B组和 A组诱导的免疫应答类型均以 Th1应答为主。结论 :以 DNA prim ing-protein boost的策略可有效诱导较 DNA疫苗单独使用更高的特异性抗体应答 ,且以

猪γ干扰素基因的克隆、表达及其纯化

以RT PCR方法 ,从经丝裂原诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出编码猪IFNγ的基因。经测序证实后插入载体pJLA 5 0 3 ,并实现在大肠杆菌中的高表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经 7mol/L盐酸胍变性及精氨酸存在的情况下复性。再经DEAE Sepharose离子交换柱、Sephdex 2 0 0凝胶过滤柱分离获得电泳单一纯猪IFN γ蛋白 ,细胞病变抑制实验检测纯化产物有干扰素活性。

肿瘤坏死因子α基因多态性对强直性脊柱炎的易感性和临床表现型的影响

目的 :探讨 TNF- α基因启动子 - 2 38和 - 30 8位点多态性对强直性脊柱炎 (AS)易感性和临床表现型的影响。方法 :采用 DNA直接测序法 ,对 1 0 8例 AS患者和 1 0 0名正常对照者 TNF- α- 2 38和 - 30 8位点进行基因分型 ,并分析基因型与疾病临床表现之间的关系。结果 :AS组 TNF-α - 2 38G/ G基因型有 1 0 6例 (98.1 % ) ,- 2 38G/ A基因型有 2例 (1 .9% ) ,正常对照组两种基因型分别有 95例 (95 .0 % )和 5例 (5 .0 % ) ,两组间比较无显著性差异 ;AS组 TNF-α - 30 8.1 .1 (G/ G)基因型有 89例 (82 .4 % ) ,- 30 8.1 .2 (G/ A)基因型有 1 9例 (1 7.6 % ) ,正常对照组中 - 30 8.1 .1 (G/ G)有 85例 (85 .0 % ) ,- 30 8.1 .2 (G/ A)有 1 4例 (1 4 .0 % ) ,- 30 8.2 .2 (A/ A)有 1例 (1 .0 % ) ,两组比较亦无显著性差异。 AS患者根据 X线判定的疾病严重程度在TNF-α - 30 8位点 G/ G、G/ A基因型之间有显著的不同 ,- 30 8.1 .2 (G/ A)基因型发病较轻 (P<0 .0 5 )。 结论 :在所研究的人群中未发现 TNF-α基因启动子 - 2 38和 - 30 8位点多态性与 AS的易感性相关 ,但 TNF-α基因启动子 - 30

猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗的免疫保护性研究

目的 :研究猪囊尾蚴副肌球蛋白 (Ag B)核酸疫苗诱发的免疫应答。 方法 :将 pc DNA3- Ag B核酸疫苗肌注 4～ 6周龄的昆明种小鼠 ,从 2周后开始用 EL ISA方法检测小鼠体内 Ig G和 Ig G2 a的水平。另外将该核酸疫苗注射 C5 7BL / 6小鼠 ,体外培养小鼠脾细胞 ,用刀豆蛋白 A (Con A)和特异性抗原刺激 ,EL ISA试剂盒检测细胞因子 IL - 2和 IL - 4的水平 ,并观察脾淋巴细胞增殖反应。另外 ,将该核酸疫苗肌注瘦型仔猪 ,进行攻击实验 ,计算相对保护率。结果 :注射疫苗后的第 3周起 ,Ig G即为阳性 ,持续升高至第 8周 ;从第 2周起 ,小鼠血清 Ig G2 a为阳性 ,第 4周达到高峰。细胞因子检测表明 ,IL- 2水平远远高于空载体对照组 ,而 IL- 4含量却与空载体对照组无显著差异 ;实验组刺激指数明显高于空载体对照组。副肌球蛋白核酸疫苗对仔猪的相对保护率为 80 %。 结论 :猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗在小鼠动物实验中引发了以 Th1型免疫应答占优势的全面免疫应答。pc DNA3- Ag B核酸疫苗对仔猪具有较好的免疫保护性。

毕赤酵母重组猪囊尾蚴抗原cC1的特征研究

目的 研究毕赤酵母重组猪囊尾蚴抗原cC1蛋白的特征变化。方法 对表达产物行SDS -PAGE ,FPLC离子交换层析和分子筛 ,等电聚焦 ,脱磷酸反应 ,N端氨基酸测序 ,小鼠免疫接种。结果 毕赤酵母重组猪囊尾蚴抗原cC1蛋白的分子量较原核的大 ,易于纯化 ,等电点较理论值低 ,重组cC1已被磷酸化 ,N端携带了来自载体的 4个氨基酸 ,免疫原性较原核的明显增强。结论 毕赤酵母重组猪囊尾蚴抗原cC1蛋白的特征较原核的有了明显变化 ,尤其是蛋白易于纯化及免疫原性的增强 ,表明毕赤酵母表达系统非常适合重组亚单位疫苗的生产制备。

以融合蛋白为抗原的简化Westernblot法诊断囊虫病

目的：为囊虫的诊断提供简便有效的方法。方法：猪囊尾蚴ｃＤＮＡ表达文库中筛选出的β－半乳糖苷糖－猪囊虫ｃＤＮＡ编码的融合蛋白为抗原，进行简化的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果：四个克隆的融合蛋白（ｃＣ１、ｃＣ２、ｃＰ１和ｃＨ１）联合使用，检测１２４例人囊虫病血清中的抗囊尾蚴ＩｇＧ抗体，阳性率达９３．７％，三个克隆的融合蛋白（ｃＣ１、ｃＣ２、和ｃＰ１）联合使用，检测３８例猪囊虫病血清中的相应抗体，阳性率达１００％，均高于各克隆融合蛋白单独使用的阳性率，且与其他寄生虫病血清无交叉反应。结论：以融合蛋白为抗原所进行的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析具有高度灵敏性和特异性，且简便易操作。

膜联蛋白32与低分子质量单链尿激酶融合基因的构建及高效表达

目的：构建膜联蛋白32（annexin32，Anx32）和低相对分子质量单链尿激酶（ScuPA32k）的融合基因，并在大肠杆菌系统内作表达。方法：利用重叠区扩增法进行基因拼接，然后在谷胱甘肽S转移酶原核表达系统内表达，Western印迹验证表达产物。结果：重叠区扩增得到 1．8 kb融合基因，该基因在原核表达系统内得到高效表达，表达量占菌体总蛋白的 26％，Western印迹证明表达产物正确。结论：用重叠区扩增法进行基因拼接快速、简便。

猪囊尾蚴抗原cC1在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的 克隆并在巴斯德毕赤酵母中表达猪囊尾蚴抗原cC1。方法 用PCR法在cC1cDNA5′端引入所需限制酶位点和酵母分泌信号肽 ,与酵母表达载体pPIC9k重组 ,构建表达质粒 pPIC9k -cC1。采用电穿孔法转化酵母菌SMD116 8,在MD平板上筛选重组克隆 ,用G4 18快速筛选高拷贝转化子 ,阳性克隆经甲醇诱导表达后 ,培养上清SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果 PCR产物经测序无误 ,pPIC9-cC1和 pPIC9k -cC1酶切分析与预期相符 ,获取 86 3个酵母阳性重组克隆及9个高拷贝转化子。表达产物cC1的分子量约 4 2kDa ,占分泌总蛋白 80 %以上 ,产物浓度为 2 0 0 - 35 0mg/L。Westernblot证实表达产物具有天然cC1分子的免疫原性。结论 在巴斯德毕赤酵母中成功表达了猪囊尾蚴cC1抗原 。

核酸疫苗pcDNA3-γcC1诱导囊尾蚴细胞凋亡的作用

目的 :观察核酸疫苗 pc DNA3- γc C1免疫接种后动物宿主体内囊尾蚴的细胞凋亡现象 ,探讨治疗型核酸疫苗的作用机制。 方法 :分离、培养囊尾蚴混合细胞 ,用原位末端标记 (TUNEL)法分别检测免疫接种组、非接种组以及培养诱导对照组细胞凋亡情况。结果 :非接种组 ,且未经凋亡诱导的细胞核无凋亡所特有的阳性着色 ;经诱导或免疫接种组的细胞核均表现为极强的凋亡所特有的阳性着色。 结论 :首次观察到核酸疫苗接种后引起寄生生物细胞凋亡的现象 。

Western blot法诊断囊虫病的应用研究

目的：探讨四种猪囊尾蚴（Ｃｙｓｔｉｃｅｒｃｕｓｃｅｌｕｌｏｓａｅ）特异性抗原ｃＣ１、ｃＣ２、ｃＰ１、ｃＨ１（分子量分别为２８ｋＤａ、１８ｋＤａ、１４ｋＤａ、３４ｋＤａ）混合应用诊断人囊虫病的价值。方法：以猪囊尾蚴ｃＤＮＡ表达文库中筛选出的β－半乳糖苷酶－猪囊虫特异性抗原ｃＤＮＡ编码的融合蛋白（ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＦＰ）为抗原，作简化的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（ｉｍｐｒｏｖｅｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ＩＷＢ）分析，检测１０７例囊虫病、４０例华支睾吸虫病、２４例包虫病和３４例健康人血清对融合蛋白的反应。同时应用粗制抗原（ｃｒｕｄｅａｎｔｉ－ｇｅｎ，ＣＡ）进行ＥＬＩＳＡ、ＩＨＡ对比检测。结果：在简化Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测中，ＦＰ被１０７例囊虫病患者血清中９４例（８７．９％）血清所识别，与华支睾吸虫病、包虫病患者及健康人血清无交叉反应，特异性为１００％。以粗制抗原作ＥＬＩＳＡ、ＩＨＡ检测囊虫病人血清中的ＩｇＧ抗体阳性率分别为８４．１％和７４．８％，与华支睾吸虫病患者血清存在交叉反应，假阳性率分别为２．５％、１２．５％；与包虫病患者血清存在交叉反应，假阳性率分别为８．３％、１６．７％；与健康人血清也存在交?

利用生物信息学鉴定新发现的膜联蛋白亚家族anx32

目的：对抗原基因cC1进行结构分析和初步功能研究。方法：利用网上生物信息学软件进行cC1的一级结构、二级结构分析，同源建模预测三级结构。白陶土部分凝血活酶时间（KPTT）检测重组蛋白GST－anx32的抗凝血活性。结果：cC1在核酸水平和氨基酸水平均与膜联蛋白基因同源，具有4个同源结构区域，且每一个同源区域均具有膜联蛋白的典型motif“G－X－G－T（38 residues）－D／E”。抗凝血实验表明大肠杆菌表达的谷胱甘肽转移酶－cC1融合蛋白具有很强的抗凝血活性。结论；抗原基因cC1具有膜联蛋白家族的典型特征，但与已知的31个亚家族氨基酸序列的同源性均低于48％，因此是一个新的膜联蛋白亚家族成员，命名为膜联蛋白32（anx32）。为进一步研究其生理功能及核酸疫苗pcDNA3－γcC1诱导囊尾蚴细胞凋亡的分子机制打下了基础。

猪囊尾蚴副肌球蛋白cDNA中CpG序列的免疫激活作用

目的 探讨猪囊尾蚴副肌球蛋白 (又称为AntigenB ,AgB)cDNA中CpG序列的免疫激活作用。 方法 以pcDNA3 AgB质粒疫苗、CpG序列突变的pcDNA3 AgB′质粒疫苗、pcDNA3载体质粒和AgB蛋白质分别免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,2wk后开始用ELISA检测小鼠血清中IgG和IgG2a的效价。 结果 免疫接种的第 2周起实验组IgG与IgG2a效价开始升高 ,至第 4周达到峰值。其中以pcDNA3 AgB组升高最为显著 (P <0 0 5 )。 结论 pcDNA3 AgB核酸疫苗所诱导的小鼠免疫反应 ,不仅具有其表达产物AgB蛋白的抗原作用 ,AgBcDNA中的CpG序列也具有免疫激活作用。