兔胫骨骨膜去细胞生物支架制备方案的优化

目的探讨制备兔胫骨骨膜去细胞生物支架的最佳方案。方法取健康新西兰大白兔70只，游离双侧胫骨近端内侧骨膜，共获取骨膜标本140个。用以下三种方案处理骨膜：方案1，物理冻融（-80℃，24h），置入含体积分数2％Triton-X100和3．5×10^-3mol／LPMSF的脱细胞混合液中振荡18h，10g／LSDS溶液中振荡12h，酶消化（DNA酶、RNA酶）；方案2，SDS仅振荡6h，其他同方案1；方案3，改10g／LSDS溶液中振荡12h为0．5mol／LNaCl溶液中振荡12h，其他同方案1。三种方案制备的支架及未处理的新鲜骨膜通过HE、DAPI和基因组DNA定量分析测定细胞结构及DNA含量是否小于评价去细胞的标准浓度50ng／mg；以番红“O”染色、Masson染色和羟脯氨酸测定法定性、定量检测骨膜细胞外基质主要成分（胶原、糖胺聚糖）的保留情况；以扫描电镜观察骨膜去细胞生物支架的表面微结构；以异体皮下包埋实验观察支架的炎细胞浸润等免疫排斥反应及组织重构现象。结果经方案1、2和3处理后，HE染色切片光镜下去细胞支架均无残留细胞，DAPI荧光染色未发现细胞核及核碎片存在，DNA定量检测组织去细胞率均达95％以上且含量均小于50ng／mg。方案3与方案1和2相比，骨膜去细胞支架中主要成分[胶原定量（36．94±0．70）μg／mg]保留更加完整，电镜下观察支架的胶原连续无断裂，胶原纤维排列规整，完整性好；异体皮下包埋后炎细胞浸润较少，免疫排斥反应不明显，并出现支架降解及重构现象。结论应用物理冻融（-80℃，24h）、含体积分数2％Triton-X100和3．5×10^-5mol／LPMSF的脱细胞混合液中振荡18h、0．5mol／LNaCl溶液中振荡12h及酶消化（DNA酶、RNA酶）处理后的骨膜生物支架去细胞更彻底，细胞外基质结构和成分保留更完整，且植入体内后免疫排斥反应小，生物相容性好。