秀珍菇染料脱色过氧化物酶基因的克隆及表达分析

通过对经低温刺激(10℃)和恒温(26℃)培养的秀珍菇菌丝体进行高通量转录组测序,利用生物信息学分析筛选获得秀珍菇染料脱色过氧化物酶全长基因(命名为PpDypA)。为了探究PpDypA在低温刺激后菌丝体中的功能与表达情况,克隆基因后进行生物信息学分析,结果表明该基因全长为1515 bp,编码504个氨基酸,其蛋白相对分子质量约54.8 kDa。氨基酸序列系统进化分析结果显示,染料脱色过氧化物酶家族具有很高的同源性,PpDypA编码蛋白与紫孢侧耳亲缘关系最近。经实时荧光定量PCR检测,该基因在秀珍菇经过低温处理后表达量显著上升,推测其可能经低温诱导表达,促使菌丝体启动抗氧化防御系统缓解低温逆境胁迫,且促进木质素降解从而为原基形成提供营养和能量。

Na^+/H^+逆向转运蛋白与植物耐盐性关系研究进展

Na+/H+逆向转运蛋白与植物的耐盐性有密切的关系。在高等植物体内,主要存在两种Na+/H+逆向转运蛋白,分别为位于细胞质膜上的逆向转运蛋白SOS1,以及存在于液泡膜上的AtNHX1。质膜Na+/H+逆向转运蛋白主要负责Na+的外排,液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白主要负责把Na+区隔化入液泡。过量表达质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1或液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1能够明显提高植物的耐盐性。对植物中Na+/H+逆向转运蛋白及其与植物耐盐性之间的关系最新研究进展作一概述。

扶肺煎联合顺铂对Lewis肺癌移植瘤生长及VEGFA、VEGFR-2的影响

目的:观察扶肺煎对C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用,研究其对增殖细胞核抗原(PCNA)、血管内皮生长因子(VEGFA)及其受体(VEGFR-2)的影响。方法:70只雄性SPF级C57BL/6小鼠随机建立Lewis肺癌移植瘤模型,分别为空白对照组、模型对照组、扶肺煎低剂量组、扶肺煎中剂量组、扶肺煎高剂量组、顺铂组、扶肺煎中剂量联合顺铂组。每天观察动物一般情况及各组小鼠皮下结节情况并称重。第15天脱颈处死全部小鼠,完整剥离肿瘤组织并称重,计算各组抑瘤率及增效率,检测PCNA、VEGFA及VEGFR-2的表达。结果:扶肺煎联合顺铂组的抑瘤率最高,为65.81%。扶肺煎联合顺铂组增效率为107.91%,表明其对顺铂具有较好的增效作用。扶肺煎联合顺铂组PCNA阳性表达率低于其余各组,但差异无统计学意义(P>0.05)。扶肺煎联合顺铂组VEGFA、VEGFR-2的表达量均小于其余各组。结论:扶肺煎联合化疗可降低C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤中PCNA的表达并抑制肿瘤生长,降低Lewis肺癌移植瘤中VEGFA、VEGFR-2的表达,起到抑制肿瘤血管生成及增敏增效的作用。

扶肺煎对Lewis肺癌移植瘤的抑制作用及机制研究

目的:观察扶肺煎对C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用,研究其对STAT3磷酸化水平及对Bcl-2、Bax、Cyclin D1、CDK4基因表达的影响。方法:70只雄性SPF级C57BL/6小鼠随机建立Lewis肺癌移植瘤模型,分别为空白对照组、模型对照组、扶肺煎低剂量组、扶肺煎中剂量组、扶肺煎高剂量组、顺铂组、扶肺煎中剂量联合顺铂组。每天观察动物一般情况及各组小鼠皮下结节情况并称重。第15天脱颈处死全部小鼠,完整剥离肿瘤组织并称重,计算各组抑瘤率及增效率,检测p-STAT3的表达及Bcl-2、Bax、Cyclin D1、CDK4基因的表达。结果:扶肺煎联合顺铂组的抑瘤率最高,为66%,扶肺煎对顺铂组的增效率为108%,表明其对顺铂具有较好的增效作用。各给药组p-STAT3表达均下降。各给药组Bcl-2、Cyclin D1、CDK4基因表达均下降,Bax基因表达上升。结论:扶肺煎联合化疗可降低C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤中磷酸化STAT3的表达并抑制肿瘤生长,降低Lewis肺癌移植瘤中Bcl-2、Cyclin D1、CDK4基因的表达,同时提高Bax基因的表达,起到控制细胞生长及分化、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。

异鼠李素通过mTOR通路抑制肺癌增殖、侵袭及其机制研究

目的:观察异鼠李素对人肺癌细胞A549、SPC-A1的抑制作用,研究其对CyclinD1、CDK4表达及mTOR磷酸化水平的影响。方法:不同浓度异鼠李素处理人肺癌A549、SPC-A1细胞,采用CCK-8法检测A549、SPC-A1细胞的存活能力;采用划痕实验检测细胞迁移能力;通过Transwell检测细胞体外侵袭能力;采用Western blot法检测A549、SPC-A1细胞中CyclinD1、CDK4、mTOR、p-mTOR蛋白表达;采用RT-PCR法检测细胞中CyclinD1、CDK4 mRNA表达。结果:不同浓度异鼠李素对A549、SPC-A1的增殖具有明显的抑制作用,且随着浓度的升高,抑制作用更加明显。不同浓度异鼠李素作用于A549、SPC-A1后,肺癌细胞的迁移及侵袭能力均有所减弱,接近SC66及顺铂处理水平。与空白对照组比较,不同浓度的异鼠李素可明显抑制CyclinD1、CDK4蛋白表达,并且在一定程度上降低mTOR的磷酸化水平。同时各实验组CyclinD1、CDK4 mRNA表达水平也显著降低。结论:异鼠李素对肺癌细胞增殖具有抑制作用,同时能抑制细胞迁移及侵袭,其机制可能与抑制mTOR信号通路的磷酸化有关。

重组抗HER2人源化单克隆抗体大规模制备及活性鉴定方法学建立

目的建立大规模表达重组人源化HER2单克隆抗体(Anti-her2)并测定重组抗体活性的方法。方法利用Anti-her2重链、轻链真核表达载体质粒共同转化CHO细胞,筛选稳定表达株,然后放大培养,并利用Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE、HPLC检测产物纯度,Western blot检测产物特异性,同时比较重组抗体的活性。结果筛选得到1株稳定表达的细胞株,收液后蛋白BCA定量为135.9 mg·L-1。纯化后获得的目的蛋白相对分子质量约为185 kD,蛋白纯度在99%以上,与商品化的“赫赛汀”一致;活性检测显示其活性与“赫赛汀”相当,细胞实验揭示其能显著抑制BT-474细胞增殖及胞内HER2的表达。结论该方法筛选获得的重组蛋白,与商品化药物性质基本一致,这为重组抗体药物的大规模悬浮培养放大和工业化生产奠定了基础。

利用植物生物反应器表达药用蛋白FC-IL-1ra

目的:构建植物双元表达载体pMCP0-FC-IL-1ra转化根癌农杆菌GV3101并侵染胡萝卜悬浮细胞,筛选得到的阳性细胞24孔板培养1周后,检测上清中FC-IL-1ra蛋白的表达。方法:用PCR的方法扩增得到含组织型纤溶酶原激活物(tPA)分泌型信号肽的FC-IL-1ra片段,并将其连接至测序载体pGEM-T Easy中,测序正确后将FC-IL-1ra片段酶切连接至植物表达载体pMCP0中,经PCR及酶切验证插入片段的正确性。重组质粒经农杆菌GV3101介导转染胡萝卜悬浮细胞,经潮霉素筛选得到阳性克隆,24孔板培养后取上清检测蛋白表达,dot blotting检测及Western blotting验证分泌蛋白FC-IL-1ra。结果:成功构建了植物双元表达载体pMCP0-FC-IL-1ra,转化胡萝卜悬浮细胞后筛选得到阳性克隆,经dot blotting检测获得6个表达较高的细胞克隆,经Western blotting确认获得能分泌FC-IL-1ra蛋白的胡萝卜悬浮细胞株系,但分泌表达的FC-IL-1ra在IL-1ra中间某一位置有断裂。结论:成功构建了植物双元表达载体pMCP0-FC-IL-1ra,并在植物悬浮细胞体外实现了Fc-IL-1ra融合蛋白的分泌表达,证明了利用植物细胞大规模表达药用蛋白的可行性。

药用植物胡萝卜悬浮细胞系的建立及其相关转基因研究

目的:建立药用植物悬浮细胞系,筛选稳定合成次生代谢产物的转基因生产细胞株。方法:诱导胡萝卜(Daucus carota L.)愈伤组织,并建立胡萝卜悬浮细胞系。利用植物双元表达载体p MC-GUS转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101并侵染胡萝卜悬浮细胞,经潮霉素筛选得到阳性克隆,24孔板培养后离心检测GUS表达,GUS染色较深克隆100 m L锥形瓶传代1月,再次染色确认基因整合稳定性。结果:驯化获得胡萝卜悬浮细胞系,转基因后筛选得到阳性克隆,经GUS检测获得表达较高的细胞克隆,克隆于100 m L锥形瓶传代1月,GUS染色确认基因已稳定整合至胡萝卜悬浮细胞基因组。结论:成功驯化获得胡萝卜悬浮细胞系,并通过转基因技术筛选得到表达GUS蛋白的转基因悬浮细胞株,基因稳定整合至胡萝卜细胞基因组。该方法筛选得到的转基因细胞株具备开发成为生产细胞系的潜能。

激光熔覆制备Fe-30Mn-xCu合金的性能研究

为了进一步探究骨植入物用可降解金属铁锰合金的降解行为,采用激光熔覆技术制备Fe-30Mn-xCu(x=0,4%,6%,8%,10%,12%,质量分数)可生物降解骨替代合金,并通过光学显微镜、扫描电镜及其附带的能谱仪、X射线衍射仪、显微硬度计、电子万能试验机、高温摩擦磨损试验仪和电化学工作站等探讨了铜含量的变化对合金微观结构、力学性能及生物降解行为的影响。结果表明:铜的含量对合金的晶粒尺寸、硬度、强度、摩擦磨损性能、降解速率的影响均较大。随着铜含量的升高,晶粒尺寸减小,硬度上升,极限抗压强度上升,耐磨性先增强后减弱,降解速率先增加后下降,在10%铜时,耐磨性最好,铜含量6%时,降解速率最大。

药用真菌桑黄分子鉴定及遗传多样性分析

通过对不同来源的桑黄菌株进行分子鉴定和遗传多样性分析,为后续桑黄种质资源的研究、开发及利用提供参考。采用r DNA ITS序列分析技术,对收集到的国内22个桑黄菌株进行分子鉴定与遗传多样性分析。依据r DNA ITS序列计算遗传距离并构建系统发育树,结果显示收集到的桑黄菌株明确聚为3个独立类群,且3个类群的桑黄真菌存在明显的遗传分化。通过BLAST分析,成功鉴定出3类桑黄种质分别为:桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)、杨树桑黄(Fuscoporia gilva)及丁香桑黄(Inonotus baumii)。不同来源的桑黄菌株间具有一定的遗传多样性,种间遗传趋异度显著高于种内。本研究结果提供了一种准确可靠且简单易行的桑黄真菌分子鉴定技术,可明确各桑黄真菌的种属来源及遗传结构组成,为桑黄真菌的进一步研究及开发应用奠定了基础。

中药抑肺饮对Lewis肺癌移植瘤生长及细胞EMT的影响

目的:观察中药抑肺饮对C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用,研究其对细胞EMT的影响。方法:70只雄性SPF级C57BL/6小鼠随机分组为空白对照组、模型组、顺铂组、抑肺饮联合顺铂组、抑肺饮高剂量组、抑肺饮中剂量组和抑肺饮低剂量组,建立Lewis肺癌移植瘤模型,给药15 d后脱颈处死小鼠,取肿瘤组织并称重,计算各组抑瘤率。对肺组织进行HE染色观察各组小鼠肺组织病理变化情况,同时检测肿瘤组织中E-cadherin和Vimentin的表达情况。结果:抑肺饮具有抗肿瘤作用,其中抑肺饮联合顺铂组的抑瘤率最高,为72.39%。与模型组相比较,抑肺饮作用组瘤组织中的E-cadherin表达量呈上调趋势,Vimentin的表达量呈下调趋势,其中抑肺饮联合顺铂组的差异最为明显。结论:抑肺饮联合顺铂组显著抑制了C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长及Vimentin的表达,同时,上调E-cadherin的表达,说明抑肺饮的作用机制可能和调节肿瘤细胞EMT相关。

健脾1号方对人结肠癌细胞作用及其机制研究

目的:探讨健脾1号方抑制人结肠癌细胞增殖和干细胞特性的作用机制。方法:以人结肠HCT116癌细胞株为模型,通过MTT实验检测不同浓度(0.4、2、10及50 mg/m L)健脾1号方对HCT116细胞的增殖抑制作用;以无血清悬浮培养实验检测健脾1号方对HCT116细胞干细胞特性的影响;通过Western-blot检测健脾1号方对HCT116细胞钙黏附蛋白E(E-cadherin)表达的影响。结果:健脾1号方对HCT116生长具有抑制作用,且导致细胞形态发生变化,干预24、48及72h后的IC50值分别为2.32、1.78、1.31 mg/m L;健脾1号方具有抑制HCT116细胞成球能力,上调E-cadherin蛋白表达。结论:健脾1号方对HCT116细胞生长和干细胞特性具有明显的抑制作用,其机制可能和调节细胞上皮间质转化(EMT)有关。

秀珍菇原基形成相关基因PpFBD1的克隆与表达研究

前期研究中通过对秀珍菇经低温诱导后不同发育阶段样本进行转录组测序及差异表达基因分析发现,ID为Cluster-6377.64510的基因(命名为PpFBD 1)在原基形成前期的样本中高表达。为进一步了解分析其表达特性及功能,根据转录组测序结果设计特异性引物,利用RT-PCR技术从秀珍菇中克隆获得了该基因的cDNA全长。该基因由342个核苷酸组成,编码一个由113个氨基酸组成的蛋白,蛋白相对分子质量约11 ku。进化树分析显示,PpFBD 1编码蛋白与糙皮侧耳hydrophobin 1编码的疏水蛋白亲缘关系最近。Gene Ontology功能分析表明,PpFBD 1主要参与真菌类细胞壁的合成。荧光定量RT-PCR检测显示,该基因在菌丝体经低温诱导后恢复至室温阶段(原基形成前期)表达量最高,这表明其可能参与调控秀珍菇原基形成过程。本研究结果为阐明秀珍菇原基形成机制提供参考。

扶肺煎对Lewis肺癌移植瘤生长及肿瘤微环境中Foxp3^(+)Tregs、Foxp3、IL-10、TGF-β的影响

目的研究扶肺煎对C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤生长及肿瘤微环境中Foxp3^(+)Tregs、Foxp3、IL-10、TGF-β的影响。方法选取雄性C57BL/6小鼠建立Lewis肺癌移植瘤模型,随机分为6组:模型组,扶肺煎低、中、高剂量组,顺铂组和扶肺煎中剂量联合顺铂组,每组8只。观察小鼠的一般情况及移植瘤大小。给药第15天后剥离肿瘤组织,计算各组抑瘤率;FCM检测肿瘤微环境中Foxp3^(+)Tregs数量;免疫组化法检测Foxp3表达量;ELISA检测外周血细胞因子IL-10、TGF-β的表达水平。结果与模型组比较,各组平均瘤重均减小,顺铂组、扶肺煎中剂量联合顺铂组缩小明显(P<0.01),扶肺煎中剂量联合顺铂组抑瘤率最高(64.23%);扶肺煎中剂量联合顺铂组移植瘤中Foxp3^(+)Tregs数量减少(P<0.05),其余各实验组Foxp3^(+)Tregs数量减少均无统计学意义;扶肺煎高剂量组、顺铂组、扶肺煎中剂量联合顺铂组移植瘤中Foxp3表达量下降(P<0.01)。扶肺煎中剂量组、扶肺煎高剂量组、顺铂组、扶肺煎中剂量联合顺铂组外周血中细胞因子IL-10、TGF-β水平下降(P<0.01),IL-10下降幅度大。与顺铂组相比,扶肺煎中剂量联合顺铂组IL-10水平下降(P<0.01)。结论扶肺煎能有效抑制肺癌移植瘤的生长,对调控移植瘤微环境中Foxp3^(+)Tregs数量影响不明显,对干预肿瘤微环境中Foxp3、TGF-β具有一定影响,对IL-10的影响十分显著。

植物细胞质雄性不育及其在育种中的应用

细胞质雄性不育的研究在杂种优势利用上具有重要的实践意义。主要以能量为切入点阐述了植物线粒体引起细胞质雄性不育的作用机制,对提出的2种主要假说做了相关分析;从转录后调控和翻译后调控2个层面对育性恢复的机制作了详细的阐述;综述了近年来细胞质不育在植物育种上的应用所取得的成就。随着对多个物种全基因组和线粒体基因组序列测序的完成以及比较基因组学和生物信息学方法的建立和不断完善,相信对细胞质雄性不育机制的研究会有很大的进展。

柴可群治疗膀胱癌临证经验浅析

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,其中男性的发病率远远高于女性[1]。随着医学的进步,膀胱癌的治疗手段呈多元化,然而中医药在治疗过程中仍有十分重要的作用。笔者有幸侍诊柴可群主任中医师,受益匪浅,现总结其治疗膀胱癌经验如下,以飨同道。

努力开拓市场 运输企业走出困境

改革开放以来,随着国营、集体、个体一齐上,有路大家行车,有河大家行船的交通运输体制转变,许多公路运输企业在多家竞争面前缺乏经营策略,措施不力,以致在激烈的竞争中处于被动。如广西南宁汽车总站,1983年曾盈利1100多万元受到国家交通部的表彰,市场放开后,1988年竟亏损117万元;又如南宁市运输公司,1984年以前也是盈利企业,可是至今已变成严重的亏损单位,仍处于困境中。在求生存、求发展的竞争中,各企业都采取过不同的措施,南宁汽车总站在行业开放的初期,曾凭借运力雄厚派出车辆对新营的客车实行前后“夹击”,针锋相对,试图以这一方式驱使竞争对手退出运输市场。实际上,市场之广阔,改革洪流势不可挡,依靠简单的手段,把竞争眼光仅限于单一的市场上是难以如愿的。路在何方?迄今,

房屋建筑工程管理措施

文章阐述了房屋建筑工程管理的意义,分析了房屋建筑工程管理中存在的问题,提出了房屋建筑工程管理的优化措施,包括建立科学的监督管理体系、提升施工人员及管理人员的专业能力、优化建筑工程招投标管理流程、采用先进的信息技术。

扶肺煎抑制肺癌增殖和转移的体内外研究

【目的】观察扶肺煎对肺癌增殖和转移的抑制作用。【方法】(1)体外研究:制备扶肺煎含药血清,以信号转导与转录激活因子(STAT3)抑制剂AG490、顺铂为阳性对照药,培养人肺癌A549、SPC-A1细胞,采用细胞计数试剂盒8(CCK8)法测定细胞增殖情况,细胞划痕实验观察细胞迁移能力,Transwell实验观察细胞体外侵袭能力,蛋白免疫印迹法检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表达。(2)体内研究:取48只SPF级雄性C57BL/6小鼠,建立Lewis肺癌移植瘤模型,给予不同剂量扶肺煎、顺铂(阳性对照药)灌胃,第15天处死小鼠并剥离肺脏观察转移灶情况,将移植瘤称质量,计算抑瘤率及肺转移抑制率,并采用免疫组织化学法检测移植瘤组织Cyclin D1、CDK4、p-STAT3表达。【结果】扶肺煎组的A549、SPC-A1细胞增殖能力、迁移及侵袭能力均低于空白对照组,接近AG490及顺铂处理水平。在体内,扶肺煎高剂量组、顺铂组的抑瘤率分别为26.67%、52.53%,肺转移抑制率分别达到了28.76%、33.82%,且各给药组p-STAT3、Cyclin D1、CDK4表达水平均有所下降(P <0.05或P <0.01)。【结论】扶肺煎可通过抑制STAT3蛋白的活化,降低Cyclin D1、CDK4的表达,起到控制肿瘤细胞生长及分化的作用,从而干预肺癌转移的形成。

非小细胞肺癌不同中医辨证分型患者血清microRNA表达谱分析研究

目的:研究不同中医辨证分型晚期肺癌患者血清microRNA(miRNA)表达谱差异。方法:将经病理诊断明确为非小细胞肺癌患者共9例,并按肺癌中医证型诊断标准分为气阴两虚型3例、脾虚痰湿型3例、气滞血瘀型3例,以同期健康体检者3例作为对照组,应用高通量测序法检测各组血清中miRNA的表达谱,筛选出差异表达的miRNA,实时荧光定量PCR验证结果,并进行靶基因预测及生物信息学分析。结果:在健康对照组及气阴两虚型、脾虚痰湿型、气滞血瘀型患者中分别鉴定得到791、707、773、846个已知miRNA成熟体。通过miRNA差异分析,发现hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-103b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-532-5p等4个miRNA仅在气阴两虚型患者血清中呈显著表达;hsa-miR-142-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-18a-3p等15个miRNA仅在气滞血虚型患者血清中显著表达;hsa-let-7d-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-17-5p等18个miRNA仅在脾虚痰湿型患者血清中显著表达。实时荧光定量PCR对其中部分特异表达的miRNA验证结果与高通量检测结果一致。生物信息学分析发现,差异表达的miRNA调控的靶基因主要参与细胞周期、细胞凋亡、细胞信号传导、生物调控等生物学过程。结论:不同中医辨证分型肺癌患者血清miRNA表达谱存在明显差异,提示miRNA可能通过靶基因在不同中医辨证分型肺癌患者发病过程中发挥不同的调节作用。