细胞毒性T淋巴细胞活性的检测及应用

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的测定是了解机体细胞免疫功能的重要方法,在表位鉴定、疫苗效果评价、预测移植排斥反应等研究中广泛应用,因此有效地检测其功能非常重要,本文综合叙述了主流的检测方法及其各自应用。

皮肤颗粒细胞瘤

患者女．50岁。阴部出现一硬结节5个月余，硬结节切除后再发1个月，于2006年6月来本院就诊。患者自诉6个月前无意中发现阴部出现一小硬结节，无明显自觉症状，硬结节逐渐增大，于2006年2月曾来本院就诊。当时检查发现阴阜正中有一枚黄豆大硬结节，略高出皮面，边界清楚，呈正常肤色，触之较硬，活动好，无压痛。为明确诊断，行结节切除并作组织病理检查。

11型HPVE7蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的构建人11型乳头瘤病毒(HPV 11)E7蛋白的原核表达载体,表达纯化后制备抗HPV11E7蛋白的多克隆抗体。方法构建pGEX-4T2-HPV11E7原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-HPV11E7,纯化获取11型HPVE7蛋白。将HPV11E7蛋白免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的多克隆抗体,用蛋白G琼脂糖纯化获得IgG型多克隆抗体。Western blot法及免疫荧光染色检测该抗体的效价及特异性。结果 SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导6 h后可表达出高水平可溶性GST-HPV11E7融合蛋白。纯化后免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的血清,纯化获得了IgG型多克隆抗体。Western blot及免疫荧光染色结果显示,兔抗HPV11E7 IgG具有效价高和特异性强的特点。结论成功表达了HPV11E7蛋白并制备了效价较高、特异性较好的IgG型兔抗HPV11E7蛋白多克隆抗体。

大疱性荨麻疹性血管炎1例

患者男，47岁。因四肢水肿性红斑8d，双侧胭窝水疱2d于2016年5月3日来我院就诊。患者8d前无明显诱因下双大腿内侧出现散在红色斑块。大小不一，逐渐转为暗红或暗褐色，起初高出皮面，后慢慢变平，24h内不能完全消退。斑块逐渐融合成片，偶感瘙痒，夜间明显。病程中无发热，无关节痛，无肌肉酸痛。

五味子甲素通过MAPK/ERK途径拮抗黑素细胞中黑素生成的机制研究

目的:探讨五味子甲素通过丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)/胞外信号调节激酶(ERK)途径拮抗黑素细胞中黑素生成的机制。方法:设人表皮黑素细胞组,五味子甲素低、中及高剂量组(125、250及500μmol/mL)。培养结束后,采用噻唑蓝法测定细胞活力,流式细胞仪评估细胞凋亡指数,黑素制备标准曲线测定黑色素合成能力,酶联免疫吸附试验测定酪氨酸酶水平,逆转录聚合酶链反应及蛋白质印迹法测定细胞MAPK、ERK mRNA和蛋白表达水平。结果:与人表皮黑素细胞组比较,五味子甲素低、中及高剂量组的吸光度(OD)值、存活率、黑素合成水平和酪氨酸酶水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着五味子甲素剂量的升高,人表皮黑素细胞OD值、存活率、黑素合成水平和酪氨酸酶水平逐渐降低,五味子甲素各剂量组呈剂量-效应趋势(P<0.05)。与人表皮黑素细胞组比较,五味子甲素低、中及高剂量组细胞凋亡率,MAPK、ERK mRNA和蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着五味子甲素剂量的升高,人表皮黑素细胞凋亡率,MAPK、ERK mRNA和蛋白表达水平逐渐升高,五味子甲素各剂量组呈剂量-效应趋势(P<0.05)。结论:五味子甲素能抑制黑素细胞增殖,促进黑素细胞凋亡,进而抑制黑素生成;其机制可能与五味子甲素促进人表皮黑素细胞MAPK、ERK mRNA和蛋白表达,进而激活MAPK/ERK途径有关。

咪喹莫特治疗经典型卡波西肉瘤1例

患者男，62岁。因左踝外侧黑色丘疹2个月，于2013年5月来我院就诊，无明显瘙痒、疼痛或烧灼感等。家族中无类似疾病患者。体格检查：生命体征平稳，神志清，精神可，双肺呼吸音清，未闻及明显干湿性啰音。腹平软，无明显压痛及反跳痛。双下肢无水肿，病理征阴性。

不同RNA干预技术对人乳头瘤病毒11型E7基因的沉默作用

目的探讨RNA干预技术的两种形式在体外对人乳头瘤病毒（HPV）11型E7基因的沉默作用。方法化学合成1对小片段干扰RNA（siRNA-11E7）、同时构建3个短发夹状小RNA（shRNA）表达质粒（pRNAT-11E71^#、2^#、3^#），分别转染稳定表达HPV11E7的C57BL／6小鼠黑素瘤细胞系B16细胞株，采用实时荧光定量PCR技术检测细胞转染前后靶基因mRNA的表达水平。结果siRNA-11E7转染细胞后6、12、24、48、72、96、120h对靶基因表达的抑制率分别为12.60％、31.41％、41.93％、42.93％、74．35％、32.71％、29．00％；最佳作用浓度为25nmol／L（抑制率70.06％），最低作用浓度可至3.13nmol／L（抑制率47.00％）。以0．4μg pRNAT-11E71^#、2^#、3^#及上述3个质粒等量混合转染细胞72h后对靶基因表达的抑制率分别达44．52％、59．26％、89.62％、54.09％，阴性质粒无干预作用。pRNAT-11E73^#作用6、12、24、48、72、96、120h对靶基因表达抑制率分别为0、17．50％、40．90％、42．40％、61．90％、51．50％、0％；最佳作用剂量0．2μg。结论siRNA及shRNA表达载体均可在体外安全高效地沉默HPV11E7基因的表达，其干预作用存在一定的量效性和时效性，且可能存在最佳作用浓度（剂量）和最佳作用时间。

尖锐湿疣患者外周血Foxp3^＋CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的检测及意义

目的了解尖锐湿疣患者外周血Foxp3^＋CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的表达水平，探讨其在尖锐湿疣发生发展机制中的作用。方法分别收集30例尖锐湿疣患者（复发15例，初发15例）及20例健康者外周抗凝静脉血，分离出外周血单个核细胞。藻红蛋白（PE）标记抗CD4单抗，异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗CD25单抗，细胞破膜后PE标记的抗Foxp3单抗行细胞内染色，三色流式细胞术分析Foxp3^＋CD4^＋CD25^＋调节性T细胞比例。组间比较采用ANOVA检验。结果外周血中Foxp3^＋CD4^＋CD25^＋调节性T细胞水平在尖锐湿疣患者组为（3．4±1．0）％，在复发组为（4．7±1．2）％，均显著高于健康对照组的（1．2±0．5）％（P〈0．01）。外周血Foxp3^＋CD4^＋CD25^＋调节性T细胞水平在初发组为（2．1±1．0）％，高于健康对照组，但差异无统计学意义，而在复发组明显高于初发组（P〈0．05）。结论尖锐湿疣患者外周血Foxp3^＋CD4^＋CD25^＋调节性T细胞数量增加，这种细胞免疫功能失调可能与其免疫学发病机制有关。

Toll样受体在尖锐湿疣皮损中的表达

目的 探讨尖锐湿疣皮损中Toll样受体（TLR）各亚型的表达.方法 将尖锐湿疣患者的病损组织标本冰冻切片经免疫组化染色检测10种TLR亚型的表达情况,以正常皮肤组织作对照,比较两者TLR表达谱的差异.结果 正常表皮角质层和颗粒层TLR6、9呈强阳性表达,TLR1、3、10呈中等强度表达,TLR2、4、5、7、8弱表达,棘层和基底层细胞不表达或弱表达TLR;尖锐湿疣皮损表皮中除基底层弱表达或不表达TLR外,其余细胞层TLR1、3、6、9强阳性表达,TLR4、8、10中等强度表达,TLR2、5、7弱表达.两组皮肤的真皮层均未见明显TLR阳性细胞.结论 尖锐湿疣皮损增生的角质形成细胞中TLR表达较正常皮肤明显增高,尤以TLR1、3、6、9亚型为著,可能与HPV感染启动机体抗病毒免疫有关.

系统性红斑狼疮合并Kikuchi-Fujimoto病一例

患者女，58岁。2014年1月13日因口唇红斑1个月/发热8d至浙江大学阪学院附属邵逸夫医院就诊。患者1个月前出现下唇红斑，后增大并破溃。8d前出现发热，呈间歇热型，尤畏寒/寒颤，伴全身肌肉酸痛，尤关节肿痛/口腔溃疡及光敏感等。当地医院查抗核抗体（ANA）1：l000，抗双链DNA（dsl）NA）抗体阳性（＋），红细胞沉降率（ESR）56mm／1h，补体C3 390mg/L；胸部CT示两肺慢性感染惟病变，伴两侧少堵胸腔积液，心包少量积液；予抗感染补液等治疗效果不佳。既往史和个人史无特殊。人院体格检查：神智清，精神软；下唇可处“径约2cm溃疡面，上覆血痂。左侧胸锁乳突肌前可及一豌豆大小淋巴结，表面光滑，无触痛，活动欠佳。两下肺呼吸音粗，未闻及干湿啰音。心脏、腹部无特殊。旧肢轻度非凹陷性水肿。实验室检查：白细胞2．6×109／L，，淋巴细胞0．42．6×109／L，血红蛋由94g／L；ESR 44mm／1h，C反应蛋白（CRP）8mg／L；丙氨酸转氨酶49U／L，天冬氨酸转氨酶76U／L，谷氯酰转肽牌55U／L，肾功能正常；ANA 1：320均质型，抗dsDNA抗体（＋）；IgG26100 mg／L，C3 450mg／L，C4 50Mg／L；尿常规、前降钙素原、抗溶血链球菌素O、类风湿因子及肿瘤标志物均无异常。心脏彩超：少量心包积液。骨髓常规无异常。骨髓活检：骨髓组织增生活跃。综合临床及实验室检查结果：（1）白细胞和淋巴细胞减少；（2）ANA及抗dsDNA抗体阳性；（3）补体明显降低；（4）双侧少量胸水，少许心包积液等，本例患者符合系统性红斑狼疮（SLE）的诊断标准。予甲泼尼尼40mg／d及护肝补钾补钙护胃治疗，治疗第3天复查CRP 5．7mg／L，ESR3 6mm／1h，血常规未见明显异常。下唇痂皮脱落，全身肌肉酸痛明显好转，患者主诉左颈部淋巴结肿大，B超显爪双颈、腋下多发浅表淋巴结肿大，部分皮髓质不清。遂行颈部肿大淋巴结切除术，术后病理：副皮质区扩大，内见成片分布细胞：细胞核大空泡状，核仁清晰，核分裂象易见，部分细胞核偏位，胞质红染，内见坏死及大量核碎片（图lA）。免疫组化：CD5、CD20阴性，CD3、CD8阳性（图1B），CD4散在阳性，CD68（图1C）、髓过氧化物酶（MPO）、CD7部分阳性，CD56、EB病毒编码小RNA（EBER）个别阳性，Ki-67高增殖活性（图lD）。根据淋巴结病理结果诊断为组织细胞坏死性淋巴结炎（即Kikuchi-Fujimoto病，KFD）：继续甲泼尼龙40mg/d静滴治疗1周后，患者体温恢复正常，口唇皮疹完全消退，未及浅表肿大淋巴结。糖皮质激素逐渐减星，病情无反复。

自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体检测尖锐湿疣皮损的研究

目的 采用自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体检测外生殖器尖锐湿疣皮损组织中HPV6b和11型E7蛋白的表达，探讨该抗体在临床检验中的应用价值。 方法 55例经临床和病理确诊的尖锐湿疣皮损石蜡标本，用自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体进行免疫组化检测，其中18例皮损冰冻标本用RT-PCR法测定HPV6b和11型E7蛋白mRNA表达，分析与免疫组化结果的符合率。 结果 55例尖锐湿疣皮损的免疫组化染色显示，HPV6b和11型E7蛋白为胞核染色，且皮损全层表皮细胞均有阳性表达，但基底层阳性细胞较多。HPV6b和11型E7蛋白阳性表达率分别为76.36%（42/55）和58.18%（32/55），总阳性表达率为94.55%（52/55），两蛋白双阳性率为40.00%（22/55），两蛋白均阴性表达为3例（5.45%）。18例尖锐湿疣冰冻标本经RT-PCR法检测，HPV6b和11型E7 mRNA阳性表达分别为15例和10例，双阳性表达7例，其阳性表达型别与免疫组化结果完全一致，符合率均为100%。 结论 该自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体免疫组化法检测尖锐湿疣皮损，检测结果直观，可以观察到HPV6b和11型感染细胞在病损中的分布位置。

小干扰RNA对人乳头状瘤病毒6bE7基因表达的沉默作用

目的研究靶向人乳头状瘤病毒HPV-6b型E7基因的二聚体小干扰RNA（siRNA-HPV-66E7）对靶基因表达的沉默作用。方法建立并筛选稳定表达HPV-6bE7基因的B16和293T转染细胞株，用脂质体转染法将体外合成的siRNA-HPV-6bE7转染上述细胞株，采用实时荧光定量PCR分析靶基因HPV-6bE7的mRNA表达情况。结果用不同浓度的siRNA-HPV-6bE7转染细胞48h，50nmol／L浓度对B16细胞中靶基因表达的抑制作用最强（抑制率87．05％），1nmol／L抑制作用较低（9．14％）；而在293T细胞，10nmol／L的siRNA对靶基因表达的抑制效应最大（78．87％），1nmol／L仍有一定抑制作用（46．92％）。50nmol／LsiRNA-HPV-6bE7转染B16细胞后，靶基因的mRNA表达在24h内开始受抑制（32．47％），48h作用最强（74．72％），96h作用很低（8．91％）；25nmol／L和10nmol／L的siRNA转染293T细胞后，均在24h内起效（26．66％、20．31％），抑制作用至少能维持72h（65．93％、35．23％）。结论siRNA-HPV-6bE7对B16和293T细胞外源性靶基因表达均有较强的特异性沉默作用，在不同细胞株达到最大抑制效应的siRNA浓度不同，但时效曲线的变化趋势基本一致，siRNA均在24h内起效，48—72h达到高峰，抑制作用至少能维持72h。本研究结果为下一步在动物或临床进行siRNA干扰试验提供了实验依据。

大疱性出血性播散性带状疱疹一例

患者男，72岁。因双上肢水疱8d，全身水疱结痂6d入院。患者8d前洗澡时发现右上臂2个黄豆大小的水疱，疱壁厚，疱液清亮，水疱逐渐增大、增多，波及整个右上肢。6d前右手掌、手指肿胀，出现多发大小不等血疱，右手背一大疱，直径7cm×8cm，同时左上肢带状分布粟粒大水疱。