缺氧性细胞损伤的机制研究进展

缺氧性细胞损伤(hypoxic cell damage)参与多种疾病的发生,严重危害人类的健康,因而对缺氧性细胞损伤机制的深入探索具有重要意义。目前的研究表明缺氧性细胞损伤的发生机制主要与细胞凋亡、自噬、焦亡、铁死亡、铜死亡及parthanatos密切相关。本文主要总结缺氧性细胞损伤的发生机制,阐明其关键因子及其调控机制,以期为涉及缺氧性细胞损伤的相关疾病的防治提供新思路。

细胞自噬过程、通路、调控及其与肺动脉高压的多重相关性

背景:细胞自噬是真核细胞高度保守的溶酶体降解途径,主要用于降解细胞内长寿命的蛋白质、受损的细胞器、细胞内入侵的病原微生物等。近年的研究表明细胞自噬在肺动脉高压的发生发展中具有举足轻重的作用,因而阐明细胞自噬的分子机制对肺动脉高压的治疗至关重要。目的:归纳自噬的过程和细胞信号通路对自噬的调控,整理自噬在肺动脉高压中的作用,提出研究细胞自噬的方法。方法:在CNKI、万方、维普输入检索式“细胞自噬AND细胞信号通路”,在PubMed中输入检索式“(“Autophagy”[Mesh])AND“Signal Transduction”[Mesh]”“(“Hypertension,Pulmonary”[Mesh])AND“Autophagy”[Mesh]”通过搜索后阅读标题及摘要进行初步筛选,排除陈旧及质量差的文献,最终共纳入44篇文献进行结果分析。结果与结论:近年来研究发现自噬与诸多疾病有关,自噬是否具有保护作用或有害作用尚未明确。细胞信号通路对某疾病自噬调控的研究主要有:①阐明细胞信号通路对自噬的影响;探讨细胞信号通路蛋白和细胞自噬蛋白上下游的关系;②说明某物质对细胞自噬及信号通路的影响,及该物质调控细胞自噬可能是通过某通路引起的。

OPN通过p38MAPK信号通路调控肺动脉平滑肌细胞自噬

目的探讨骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth musclecells,PASMCs)增殖、自噬的影响及其机制。方法采用免疫细胞化学法鉴定原代分离的PASMCs后,将PASMCs分为四组:空白对照组(OPN:0ng/mL)、OPN低剂量组(OPN:200ng/mL)、OPN高剂量组(OPN:500ng/mL)、OPN与p38MAPK抑制剂共培养组[OPN:200ng/mL+SB203580:10μM]。用Western blot法分别检测空白对照组、OPN低剂量组、OPN高剂量组中自噬因子Beclin1、LC3B和信号分子p38MAPK蛋白的表达水平及空白对照组、OPN低剂量组、共培养组中的p-p38MAPK、Beclin1、LC3B蛋白表达水平。用qPCR法检测空白对照组、OPN低剂量组、OPN高剂量组肺动脉平滑肌细胞中的Beclin1、LC3B mRNA表达水平。用MTT增值法检测不同浓度OPN(0、200、300、400、500ng/mL)对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。结果与空白对照组相比,OPN低剂量组和OPN高剂量组中的自噬因子如Beclin1、LC3B蛋白和mRNA的表达量均降低(P<0.05),信号分子p38MAPK蛋白的表达量增高(P<0.05),肺动脉平滑肌细胞的增殖水平也增高(P<0.05)。与OPN低剂量组比,共培养组的自噬因子Beclin1、LC3B蛋白的表达水平升高(P<0.05)。结论OPN促进肺动脉平滑肌细胞增殖,且通过p38MAPK信号通路抑制肺动脉平滑肌细胞自噬。

雪灵芝多糖的分离纯化及免疫活性评价

为分离纯化雪灵芝(Arenaria kansuensis)多糖,并对纯化组分进行分子量测定、单糖组分分析及免疫活性评价。实验采用水提醇沉法提取雪灵芝粗多糖(Arenaria kansuensis crude polysaccharide, AKCP);以DEAE-52纤维素柱对AKCP进行分离纯化,获得5个雪灵芝多糖组分AKP-1～AKP-5,进一步采用葡聚糖凝胶G-75柱对AKP-2进行分离纯化获得AKP-2a多糖组分。苯酚-硫酸法测定AKCP、AKP-2及AKP-2a的总糖含量分别为52%、70%和79%;凝胶渗透色谱-十八角度激光光散射(GPC-MALS)法检测AKP-2a的重均分子量Mw为2.07×10~5Da、数均分子量Mn为9.838×10~4Da;HPLC法检测AKP-2a是由半乳糖醛酸、甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖10种单糖组成,其摩尔比为1∶0.25∶0.01∶0.20∶0.11∶0.25∶0.61∶0.07∶0.21∶0.12;以MTT法检测体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖,AKCP、AKP-2及AKP-2a各浓度组SI水平,均明显高于对照组(P<0.05)。经NO释放实验及IFN-γELISA检测,AKP-2a各浓度组小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中二者的水平,较对照组呈浓度依赖性增高(P<0.01)。综上结果,本研究通过分离纯化,获得了总糖含量较高的雪灵芝多糖AKP-2a组分,初步确定其分子量范围及单糖组成,并证实其具有激活淋巴细胞增殖、促进巨噬细胞功能的生物活性。

骨桥蛋白通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞自噬和增殖的机制探讨

背景骨桥蛋白(osteopontin,OPN)可参与低氧引起的血管重塑,使肺动脉压力升高。但OPN调控低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)自噬在低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)形成中的作用机制尚不明确。目的探讨低氧条件下OPN对PASMCs增殖及通过PI3K/AKT/mTOR通路对PASMCs自噬的调控作用。方法原代分离PASMCs,采用免疫细胞化学法进行平滑肌细胞鉴定。将细胞分为常氧对照组(Normoxia)、低氧对照组(Hypoxia)、低氧+OPN干扰空病毒组(H+OPN EV)、低氧+OPN干扰慢病毒组(H+OPN shRNA)、低氧+PI3K抑制剂LY294002组(H+LY)。各组分别用EdU阳性标记率法检测细胞增殖能力;Western blot法检测各组PASMCs中的OPN、PI3K、AKT、mTOR及自噬相关蛋白Beclin1、LC3B的表达;透射电镜、免疫荧光法观察各组PASMCs自噬情况。结果与Normoxia组相比,Hypoxia组OPN、PI3K、AKT、mTOR、Beclin1、LC3B蛋白表达量升高(P<0.05),细胞增殖能力增强(P<0.05),自噬小体数量增多,LC3B、Beclin1红色荧光强度增强(P<0.05)。与Hypoxia组相比,H+OPN EV组各项指标无统计学差异(P>0.05),而H+OPN shRNA组和H+LY组OPN、PI3K、AKT、mTOR蛋白表达量降低(P<0.05),Beclin1、LC3B蛋白表达量升高(P<0.05),细胞增殖能力减弱(P<0.05),自噬小体数量增多,LC3B、Beclin1红色荧光强度增强(P<0.05)。结论在低氧条件下,OPN可促进PASMCs增殖并通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制PASMCs自噬。

OPN对低氧诱导的SD大鼠肺动脉平滑肌细胞自噬及增殖能力的影响

目的观察低氧条件下SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)骨桥蛋白及自噬相关蛋白Beclin1、LC3B的表达,并探讨OPN过表达及RNA干扰对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞自噬及细胞增殖力的影响。方法细胞分为6组:常氧对照组(Normoxic)、低氧对照组(Hypoxia)、低氧+OPN干扰空病毒组(H+OPN EV)、低氧+OPN干扰慢病毒组(H+OPN shRNA)、低氧+OPN过表达空病毒组(H+OPN OEV)、低氧+OPN过表达慢病毒组(H+OPN shoRNA)。各组分别用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)阳性标记率法检测细胞增殖能力、流式细胞术分析细胞周期、Western Blot法检测OPN及自噬相关蛋白Beclin1、LC3B的表达。结果经低氧干预后OPN和自噬相关蛋白Beclin1、LC3B表达相较常氧组增高(P<0.05),细胞增殖力增强(P<0.05),促进细胞周期进入S期(P<0.05);与低氧对照组相比,低氧+OPN干扰慢病毒组OPN蛋白表达量降低,Beclin1、LC3B蛋白表达量增高(P<0.05),细胞增殖能力减弱(P<0.05),细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05)。低氧条件下细胞经OPN过表达处理后,OPN过表达组OPN蛋白表达增高,自噬相关蛋白Beclin1、LC3B表达量降低(P<0.05);细胞增殖能力未进一步增强(P>0.05),细胞周期无变化(P>0.05)。结论低氧条件下PASMCs细胞增殖增强,OPN和自噬相关蛋白Beclin、LC3B表达增强。且OPN可促进低氧条件下PASMCs细胞增殖并负向调控大鼠PASMCs的自噬。

骨桥蛋白介导细胞自噬在小鼠低氧性肺动脉高压形成中的作用及机制

目的 明确骨桥蛋白(OPN)介导细胞自噬在小鼠低氧性肺动脉高压形成中的作用及机制。方法 将C57BL/6小鼠分为常氧对照组、常氧合并OPN-/-组、低氧对照组、低氧合并OPN-/-组。检测各组小鼠的平均肺动脉压(mPAP)、右心室肥厚指数(RVHI),观察肺组织形态学改变、肺动脉形态学变化情况,检测肺组织中OPN、p38MAPK、PI3K、NF-κB表达量以及自噬相关蛋白LC3B和Beclin-1的表达水平,并对上述结果做分析性研究。结果 与常氧组相比,低氧组小鼠的mPAP及RVHI呈现增高趋势(P<0.05),且低氧下OPN、p38MAPK、PI3K、NF-κB表达量以及自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1的表达水平均高于常氧组(P<0.05);与对照组相比,合并OPN-/-组测得的mPAP和RVHI降低(P<0.05),Beclin-1、LC3B的表达水平增高(P<0.05),而p38MAPK、PI3K、NF-κB的表达水平降低(P<0.05)。结论 低氧可以促进肺组织中OPN和自噬相关蛋白的表达。敲除OPN基因后自噬相关蛋白的表达水平显著增高,提示OPN对自噬具有抑制作用;OPN对低氧性肺动脉高压形成的调控可能是通过激活p38MAPK、PI3K、NF-κB信号通路来实现的。