小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及其诱导分化为肺泡上皮细胞

目的小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养技术门槛高且重复成功率低,一定程度上制约了相关研究的顺利开展。文中尝试优化全骨髓贴壁法分离培养小鼠BMSCs并探索其诱导分化为肺泡上皮细胞的有效方法。方法采用全骨髓贴壁法培养C57BL/6小鼠胫、股骨骨髓内容物,根据克隆状细胞集落大小及数量,动态调整传代时机与比例进行传代培养。取第6代细胞,计数检测细胞增殖能力,流式细胞术检测相关表面标志物,使用小气道上皮细胞培养基(SAEpi CM)进行诱导分化。结果随着传代次数增加及BMSCs的纯度逐渐提高,第6代细胞增殖速度趋于稳定,流式细胞术分析显示,第6代细胞表达造血干细胞表面标志物CD117的表达率仅为0.008 2%,但高表达骨髓间充质干细胞表面标志物CD29和Sca-1(表达率分别为99.1%和88.5%)。经SAEpi CM培养的BMSCs呈上皮样改变,并表达肺泡细胞的特异表面标志物——肺表面活性物质相关蛋白C。结论根据克隆状细胞集落大小及数量调整传代时间与比例的全骨髓贴壁培养法可有效分离培养得到小鼠骨髓间充质干细胞,并具有分化为肺泡上皮细胞的潜能。

干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力

背景:foxM1基因被认为参与了干细胞分化命运的调控,但其对间充质干细胞成骨分化的影响尚未见报道,关于foxM1基因的研究也主要集中于肿瘤领域。目的:探索干扰foxM1基因表达水平对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:全骨髓贴壁法培养SD大鼠(中山大学实验动物中心提供)骨髓间充质干细胞,构建含嘌呤霉素抗性基因的foxM1 shRNA重组慢病毒载体并转染大鼠骨髓间充质干细胞,经嘌呤霉素筛选建立foxM1稳定敲低细胞株,另设置空病毒载体组以及未转染组。使用骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基诱导培养并行茜素红染色检测其成骨分化能力,使用定量RT-PCR检测成骨相关基因的表达水平,同时提取胞核蛋白,Western blot检测β-catenin蛋白表达水平。结果与结论:(1)与空病毒载体组以及未转染组比较,foxM1敲低的大鼠骨髓间充质干细胞经成骨诱导分化后形成的骨结节数量明显增多,成骨相关基因col1a1和runx2表达水平均显著升高,但胞核β-catenin蛋白水平无明显改变;(2)干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨能力。

Ghrelin对脓毒症大鼠肺泡巨噬细胞炎症信号通路Akt、NF-κB和iNOS的影响

【目的】观察生长激素释放肽(ghrelin)对脓毒症大鼠肺泡巨噬细胞(AM)炎症信号通路蛋白激酶B(Akt)、核因子-κB(NF-κB)及诱导型一氧化氮合成酶(i NOS)的影响。【方法】24只SD雄性大鼠随机分为假手术(Sham)组、脓毒症(CLP)组、ghrelin干预(CLP+ghrelin)组与ghrelin对照(Sham+ghrelin)组。盲肠结扎穿孔(CLP)构建大鼠脓毒症模型,分别于术后3 h与5 h腹腔注射20 nmol/kg ghrelin进行干预。观察各组肺组织病理改变并评分;从支气管肺泡灌洗液(BALF)中提取AM,ELISA测定BALF中炎症因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的水平,qPCR测定AM的IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平,免疫荧光、免疫印迹检测AM的NF-κB p65、IκBα、p-IκBα等NF-κB信号蛋白、Akt、p-Akt等Akt信号蛋白和iNOS蛋白水平。【结果】Ghrelin干预组肺组织病理学评分[(6.7±0.8)分]、BALF中IL-1β[(146±12)pg/mL]和IL-6[(182±10)pg/m L]分别较脓毒症组[(10.3±0.7)分、(263±17)pg/mL和(273±5)pg/mL]降低了35.4%、44.5%和33.3%,组间差异有统计学意义(P<0.05),ghrelin干预组BALF中TNF-α与脓毒症组差异无统计学意义。Ghrelin干预组AM的IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA的表达水平分别较脓毒症组下调54.38%、53.6%和46.42%(P<0.05),且ghrelin干预组AM胞核NF-κB p65与胞浆pIκBα、p-Akt、iNOS表达较脓毒症组减少,分别减少32.58%、45.42%、27.6%和48.33%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组与ghrelin对照组上述指标差异无统计学意义。【结论】Ghrelin可降低脓毒症大鼠AM炎症调控信号通路蛋白Akt、NF-κB和iNOS的活性,进而下调AM促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达,减轻脓毒症急性肺损伤。

上调FoxM1增强骨髓间充质干细胞抗脂多糖诱导肺泡上皮细胞凋亡

【目的】本研究旨在探讨上调骨髓间充质干细胞(BMSC)的FoxM1表达水平对其抗脂多糖诱导肺泡上皮细胞凋亡作用的影响,并初步探索其可能机制。【方法】采用全骨髓细胞贴壁培养法分离获取大鼠BMSC,通过慢病毒转染技术使BMSC过表达FoxM1,利用Transwell小室构建BMSC与肺泡上皮细胞共培养体系,使用TUNEL法与Annexin V法检测不同FoxM1表达水平BMSC的抗脂多糖诱导肺泡上皮细胞凋亡作用,采用MILLIPLEX MAP液相芯片检测共培养体系中多种细胞因子的表达水平。【结果】TUNEL与Annexin V检测结果显示,相较于野生型BMSC,与过表达FoxM1的BMSC共培养的肺泡上皮细胞受脂多糖刺激后凋亡水平更低,差异均有统计学意义(P<0.05)。MILLIPLEX MAP液相芯片检测显示,上调BMSC的FoxM1表达水平可使其与肺泡上皮细胞的共培养体系中IL-13、IL-21、IL-23、MIP-1a、MIP-1b表达水平升高,而使MIP-3a表达水平降低。【结论】上调FoxM1表达水平可增强BMSC抗脂多糖诱导肺泡上皮细胞凋亡作用,可能与其改变肺泡上皮细胞某些炎症因子的释放水平有关。

牛津急性疾病严重程度评分鉴别快速序贯器官功能衰竭评分阴性脓毒症患者的临床价值

目的评价牛津急性疾病严重程度评分（OASIS）对快速序贯器官功能衰竭评分（qSOFA）阴性（qSOFA〈2）脓毒症患者的鉴别价值。方法从存储了美国贝斯以色列迪康医学中心重症监护室2001年至2012年住院患者医疗信息的监护室医学信息数据集（MIMIC-Ⅲ）中选取qSOFA阴性的脓毒症患者，同时筛选qSOFA〈2、无可疑感染且SOFA〈2的其他患者作为对照，并构建倾向性评分匹配队列以减少选择偏倚，运用ROC曲线分析OASIS鉴别qSOFA阴性脓毒症患者的价值并确定其阈值，进一步运用多因素Cox回归、logistic回归分析基于该阈值的OASIS水平与研究对象临床结局的关联。结果2273例qSOFA阴性脓毒症患者与3342例作为对照的非脓毒症患者纳入最终分析，其中1677对患者成功匹配。受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析结果显示，OASIS鉴别qSOFA阴性脓毒症患者的曲线下面积为0．753（95％C1为0．741-0．765），Youden指数法确定的阈值为26．5，相应的敏感度为67．2％，特异度为70．8％。多因素回归分析显示，OASIS〉26分别是患者28d死亡（风险比为2．80，95％CI为2．15～3．65，P〈0．01）、ICU内死亡（比值比为4．69，95％CI为2．60-8．49，P〈0．01）以及院内死亡（比值比为4．48，95％CI为3．13-6．42，P〈0．01）的独立危险因素。对匹配队列的分析结果亦类似。结论OASIS对qSOFA阴性脓毒症患者具有较高的鉴别能力。

序贯器官衰竭评估评分对老年脓毒症患者预后的预测价值

目的比较序贯器官衰竭评估(SOFA)评分对老年与非老年脓毒症患者预后预测的能力差异。方法从美国贝斯以色列迪康医学中心重症监护室2001年至2012年住院患者医疗信息数据库中根据脓毒症诊断标准筛选出脓毒症患者,以院内死亡作为主要结局,使用接收者操作特征(ROC)曲线比较入院时SOFA评分对老年(≥60岁)与非老年脓毒症患者预后预测能力的差异;在SOFA评分系统中增加年龄、心率以及体温的有关参数后,使用ROC曲线比较SOFA评分与改良SOFA评分对脓毒症患者预后预测能力的差异,并使用多因素回归模型分析改良SOFA评分与老年脓毒症患者临床预后的关联。结果共有10 206例脓毒症患者纳入分析,其中老年患者6 928例(67.88%),非老年患者3 278例(32.12%)。ROC曲线分析显示入院时SOFA评分预测老年脓毒症患者院内死亡的能力(AUC=0.67,95%CI:0.65~0.68)低于非老年患者(AUC=0.75,95%可信区间0.72~0.78)。与SOFA评分相比,增加了年龄、心率以及体温参数的改良SOFA评分对老年脓毒症患者院内死亡的预测能力显著提高(AUC=0.67比0.69,P<0.01),而在非老年患者则差异无统计学意义(AUC=0.75比0.75,P=0.77)。多因素回归模型分析显示,在校正潜在混杂因素后,改良SOFA评分与老年脓毒症患者的多个结局指标均密切相关(院内死亡:OR=1.17,95%CI:1.15~1.19,P<0.01;28天内死亡:HR=1.12,95%CI:1.10~.13,P<0.01;90天内死亡:HR=1.10,95%CI:1.08~1.11,P<0.01)。结论 SOFA评分对老年脓毒症患者的预后预测能力较非老年患者下降,通过增加年龄、心率以及体温的有关参数可提高SOFA评分对老年脓毒症患者的预后预测能力。

简化急性生理评分Ⅱ与牛津急性疾病严重程度评分对重症监护病房患者短期预后的预测价值比较

目的比较简化急性生理评分(SAPS)Ⅱ与牛津急性疾病严重程度评分(OASIS)对重症监护病房(ICU)患者短期预后预测价值的差异,以期为实际临床工作中疾病严重程度评分系统的选择提供一定的研究证据。方法从美国重症监护数据库(MIMIC-Ⅲ)(2001年至2012年)提取成年(年龄≥18岁)ICU患者的基本信息、生命体征以及相关实验室检验指标等,按各评分系统的要求分别计算SAPSⅡ与OASIS评分,以ICU内病死为首要结局指标,绘制接受者操作特征(ROC)曲线,计算并比较曲线下面积(AUC)的差异。结果共有38 468例ICU成年患者被纳入最终分析,其中男性患者占56.61%,年龄中位数为65.72岁,ICU病死率为8.28%(3185/38 468)。与存活患者相比,ICU死亡患者具有更高的SAPSⅡ(存活者vs死亡者:32分vs51分,H=3473.792,P<0.001)与OASIS评分(存活者vs死亡者:30分vs 41分,H=3422.382,P<0.001)以及更高的机械通气比例(存活者vs死亡者:22.76%vs 73.59%,χ~2=3831.865,P<0.001)。ROC曲线分析显示,SAPSⅡ评分与OASIS评分的AUC分别为0.8147(95%CI:0.8068～0.8226)和0.8123(95%CI:0.8042～0.8204),Hanley-McNeil检验显示二者AUC差异无统计学意义(Z=0.686,P=0.4928)。结论 SAPSⅡ评分与OASIS评分对成年ICU患者短期预后的预测价值并无显著差异,更加简便的OASIS评分有望成为ICU疾病严重程度评分的另一选择。

不同时点序贯器官衰竭评估评分对重症医学科患者院内死亡的预测价值比较

目的比较不同时点序贯器官衰竭评估(SOFA)评分对重症医学科(ICU)患者院内死亡的预测价值,以期为实际临床工作中合理选用SOFA评分指标提供一定的研究证据。方法从美国重症监护数据库中选择住院时间>72h的成年ICU患者,提取其基本信息与相关检验指标并计算不同时点SOFA评分,以院内死亡为结局指标,采用多因素Logistic回归分析不同时点SOFA评分与院内死亡的关联,绘制受试者工作特征(ROC)曲线并计算曲线下面积(AUC)以评价各指标的预后预测价值。结果共有11968例患者纳入最终分析,其中男性患者占56.15%,平均年龄为(64.75±16.63)岁,院内病死率为10.41%(1246/11968)。多因素Logistic回归分析显示不同时点SOFA评分均与院内死亡密切相关(P均<0.0001),ROC曲线分析显示不同时点SOFA评分预测院内死亡的能力存在差异,以T72最高(AUC=0.7246,95%CI:0.7101~0.7391)。结论对于住院时间>72h的成年ICU患者,入院后72h的SOFA评分可能具有更好的预后预测价值。

酒精依赖与重症患者预后的回顾性队列研究

目的探讨酒精依赖与重症患者的预后的关系。方法从一个可开放获取的国外重症电子临床数据库中选取重症住院患者,根据是否存在与酒精使用相关的诊断而判断其是否存在酒精依赖。利用Logistic回归和Cox回归模型校正潜在混杂因素并分析存在酒精依赖与重症患者预后(院内死亡、入院后28 d内死亡和入院后90 d内死亡)的关系。结果共纳入29487例重症患者,所有患者均在入院后24 h内转入重症监护病房治疗。研究对象的平均年龄为(63.93±17.09)岁,其中7.77%(2292/29487)的患者存在酒精依赖。在校正年龄、性别、所患疾病以及进入重症监护病房时的疾病严重程度评分等混杂因素后,存在酒精依赖是院内死亡的危险因素(比值比1.28,95%CI 1.05~1.57,P=0.0147),也是入院后28 d内死亡的危险因素(风险比1.25,95%CI 1.06~1.48,P=0.0092),但与入院后90 d内死亡无关联(风险比1.07,95%CI 0.93~1.23,P=0.3239)。结论存在酒精依赖可能是重症患者短期预后不良的独立危险因素。

间充质干细胞治疗ARDS临床研究进展

间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。大量的临床前试验显示其有望用于治疗以高病死率著称的ARDS，而相关临床研究却仍处于起步阶段。本文主要对近年来间充质干细胞治疗ARDS的临床研究进展进行综述。

间充质干细胞诱导分化为肺泡上皮细胞治疗急性呼吸窘迫综合征研究进展

以高死亡率著称的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是呼吸与重症医学领域亟需攻克的难题之一。来源广泛、体外易扩增培养的间充质干细胞(MSC)有望为ARDS的治疗提供新的有效手段。已有较多的相关研究显示了MSC治疗ARDS的有效性,而通过分化为肺泡上皮细胞修复损伤肺组织可能是其治疗机制之一。本文对MSC诱导分化为肺泡上皮细胞及其应用于治疗ARDS的研究进展进行综述,以期为该领域相关工作者提供一定的借鉴与启示。