去甲基化转移酶ALKBH5抑制新城疫病毒复制

为探究去甲基化转移酶ALKBH5对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)复制的影响,本研究通过构建慢病毒干扰细胞系和转染过表达质粒改变DF-1细胞中ALKBH5的表达量,采用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和半数组织培养感染剂量方法检测细胞感染NDV NA-1毒株后病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)基因转录、翻译和病毒粒子释放水平,并用荧光定量PCR筛选ALKBH5下游免疫因子相关靶基因。结果表明,沉默ALKBH5使NDV NP基因转录、翻译和病毒粒子释放水平明显上升;过表达ALKBH5抑制NP基因转录、翻译和病毒粒子释放;沉默ALKBH5使IL-10、IRF1等基因转录水平明显上升而抑制MDA5、IFN-β等基因的转录。结果证实,ALKBH5可能通过影响抗病毒天然免疫通路中IL-10、MDA5等相关免疫分子而负调控NDV的复制。

布鲁菌二联BCSP31-L7/L12-IL-2嵌合病毒样颗粒疫苗候选株的构建与鉴定

布鲁菌病的传统疫苗存在接种后干扰血清学诊断及可能出现毒力返强等缺点,严重干扰疫病监测,影响疫病净化。因此,本研究基于新城疫病毒样颗粒(ND virus like particles,ND VLPs)载体平台,利用昆虫杆状病毒表达系统和GPI锚定策略,以免疫增强因子IL-2、高保守性的保护性抗原蛋白L7/L12(来源猪种S2株)和羊种BCSP31蛋白(来源羊种M5株)为靶点,构建绿色、安全的布鲁菌二联嵌合型病毒样颗粒新型疫苗候选株(BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs)。PCR及免疫荧光结果表明成功构建了表达IL-2和L7/L12蛋白的重组杆状病毒,Western blot结果显示该cVLPs各组分蛋白正确表达,透射电镜观察可见表面展示纤突结构、大小约为100 nm的粒子,表明布鲁菌二联嵌合型病毒样颗粒BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs构建成功。

“新流腺”三联嵌合型病毒样颗粒疫苗的免疫效果评价

为了评价“新流腺”三联嵌合型病毒样颗粒(ND-AI-FAdV4 cVLPs)的免疫保护效果,本试验将其定量免疫至7日龄SPF雏鸡中,通过血凝抑制试验、ELISA和淋巴细胞增殖检测ND-AI-FAdV4 cVLPs诱导的体液及细胞免疫,并进行攻毒试验评价ND-AI-FAdV4 cVLPs的攻毒保护能力。结果显示,ND-AI-FAdV4 cVLPs可诱导机体产生与NDV弱毒疫苗和AIV灭活疫苗相当的HI抗体效价及针对FAdV4 Fiber2蛋白的高水平特异性抗体,NDV、AIV和FAdV4灭活病毒的分别刺激可诱导ND-AI-FAdV4 cVLPs免疫组脾脏淋巴细胞发生活化及增殖;ND-AI-FAdV4 cVLPs免疫后可提供针对NDV强毒株NA-1株、AIV H9N2株及FAdV4强毒株攻击的有效保护,降低了病毒感染所造成的病理损伤,且缩短了体内病毒载量及体外排毒时间。本研究为ND-AI-FAdV4 cVLPs疫苗的应用奠定了基础,同时也为新城疫、禽流感和禽腺病毒病多联新型疫苗的研发提供了参考。

CEF来源NDV Ex通过影响IFN-α、IFN-β、IL-1β、IL-6与iNOS促进NDV体内增殖

将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)刺激鸡成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)产生的外泌体(NDV Ex)静脉注射7日龄SPF雏鸡,通过体内成像观察NDV Ex在体内蓄积情况与主要分布器官,qPCR检测NDV Ex作用下肺脏、脾脏、肝脏病毒载量变化与Ⅰ型干扰素的表达量变化,分离肺泡巨噬细胞并进行形态学观察及表型鉴定,通过流式细胞术检测肺泡巨噬细胞在NDV Ex作用下吞噬能力的变化,评估NDV Ex在鸡体内对NDV增殖的影响。结果表明,雏鸡静脉注入NDV Ex后荧光主要分布于肺脏;qPCR结果显示NDV Ex可以促进NDV的体内感染,并抑制肺脏、脾脏与肝脏中Ⅰ型干扰素和肺泡巨噬细胞吞噬有关细胞因子(IL-1β、IL-6和iNOS)的表达;流式细胞术结果显示NDV Ex抑制了肺泡巨噬细胞的吞噬能力。

新城疫病毒mRNA疫苗的构建及鉴定

信使RNA(messenger RNA,mRNA)的核酸疫苗是近年来兴起的一种新型疫苗技术。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)是NDV的主要保护性抗原,可诱导机体产生中和抗体,是新城疫(Newcastle disease,ND)新型疫苗研发的重要靶点。本研究将NDV HN基因连接到含有T7启动子的载体中,并在其5′UTR和3′UTR分别引入人-β球蛋白的非编码区域以增强转录的mRNA稳定性,经质粒线性化、体外转录、cap加帽处理、mRNA纯化制备NDV HN-mRNA,将其转染至HEK-293T细胞中验证NDV HN-mRNA的表达效果,Western blot和免疫荧光试验结果表明构建mRNA候选疫苗可在HEK-293T细胞中高效表达抗原蛋白,为ND新型疫苗的研发提供新的思路。

新城疫、禽流感和禽腺病毒病三联嵌合型病毒样颗粒的构建及鉴定

采用新城疫病毒样颗粒载体平台和昆虫杆状病毒表达系统,将禽流感H9N2株HA、禽4型腺病毒Fiber2嵌合至新城疫病毒样颗粒载体表面进而构建“新流腺”三联嵌合型病毒样颗粒(ND-AI-FAdV4 cVLPs)。PCR及免疫荧光检测结果显示,成功构建了重组杆状病毒rBV-cFiber2;透射电镜结果显示,ND-AI-FAdV4 cVLPs直径约为100 nm、含有囊膜的空心蛋白颗粒;免疫印迹结果显示,嵌合型病毒样颗粒各组分蛋白均正确表达。本试验为新城疫、禽流感和禽腺病毒病的安全、高效病毒样颗粒新型疫苗候选株的应用奠定了基础。

m6A甲基转移酶对新城疫病毒复制的影响

m6A甲基化修饰广泛存在于真核细胞和病毒RNA中,在病毒感染过程及宿主细胞抗病毒反应中扮演重要角色,然而m6A修饰在新城疫病毒复制过程中发挥的功能并不清楚。本研究发现新城疫病毒(NDV)感染后显著增加HD11细胞RNA的整体甲基化水平,抑制甲基转移酶METTL3的表达而促进甲基转移酶METTL14的表达。进一步研究发现,抑制m6A甲基化修饰显著促进NDV NP基因的mRNA转录及翻译,过表达甲基转移酶METTL3和METTL14明显抑制NDV的复制,表明m6A甲基化修饰在NDV复制过程中起负调控作用。

传染性法氏囊病毒VP2蛋白嵌合新城疫病毒样颗粒的构建和鉴定

将传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)强毒株的保护性蛋白VP2替换新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白胞外域部分,利用杆状病毒表达系统,构建了含有IBDV候选抗原表位VP2蛋白的重组杆状病毒rBV-VP2,并通过间接免疫荧光试验鉴定杆状病毒蛋白表达正确。rBV-VP2与NDV-HN、NDV-F、NDV-M组装成病毒样颗粒(cVLPs),形成含有IBDV候选抗原表位的IBD-ND二联病毒样颗粒(IBD-ND cVLPs),利用Western blot鉴定cVLPs各组分蛋白,证明IBD-ND cVLPs各组分组装正确。IBD-ND cVLPs的构建可为我国养禽业提供一种绿色、安全且可一针多防的IBD-ND二联病毒样颗粒疫苗候选株。