金属离子对Trichoderma longibrachiatum UN32石斛碱型生物碱产量的影响

石斛碱是传统植物金钗石斛(Dendrobium nobile)的特征药用活性成分,结构上属于石斛型生物碱(dendrobine-type total alkaloids,DTTAs)。石斛碱的积累受周期和环境的影响,仅从植物中获取难以满足需求。该研究的对象Trichoderma longibrachiatum UN32是实验室前期通过复合诱变获得的产DTTAs的正突变株。为提高UN32的生物碱产量,使产物表达水平趋于稳定,该研究从UN32发酵培养基中无机盐的添加量出发,利用响应面法确定金属离子的最优配比。根据Plackett-Burman法设计筛选出对响应结果影响程度最显著的3个因素分别为Zn^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+),其最佳添加时间和添加浓度分别是Cu^(2+)0.5 mmol/L(第6天)、Fe^(2+)0.4 mmol/L(第6天)和Zn^(2+)0.7 mmol/L(第3天)。响应面统计的结果显示,当模型响应值生物碱量达最大值时,Cu^(2+)、Zn^(2+)和Fe^(2+)的浓度分别为0.54、0.69、0.39 mmol/L,此时生物碱产量达到(317.36±6.48)μg,比初始培养基提高了72.68%。综上,金属离子及其不同组合对菌株UN32生物碱的积累具有促进作用,该方法具有较好的开发价值和应用前景。

利用组培技术构建半夏杂交体系

本研究通过构建半夏品系的杂交体系并研究杂交种苗的扩繁周期,以解决半夏自然杂交成功率低、杂交种苗繁育效率低的问题。对消毒过的半夏花粉和雌蕊以TTC法测定其活力,并通过对比实验确定雌蕊的最佳培养基,对3种新的半夏品系持续培养出F_(1)代杂交苗,通过杂交苗继代探究转接周期和成苗周期。结果表明,半夏雌蕊和花粉的最佳消毒时间为6 min;雌蕊的最佳培养基配方是半糖无琼脂MS培养基20.00 g/L+蔗糖15.00 g/L+琼脂5.00 g/L+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.01 mg/L,pH=5.8。以此为基础,培育出F_(1)代苗;4种半夏品系的F_(1)代杂交苗与亲本组培苗叶型有明显区别,经过扩繁发现了两个杂交种苗的扩繁周期。本研究建立了基于植物组织培养技术的半夏杂交体系并获得杂交苗,并探明杂交种苗的繁育周期。

利用Taq DNA聚合酶直接从双链RNA模板中扩增靶序列

利用Taq DNA聚合酶既具有DNA聚合酶活性义具有反转录酶活性的特点,探索了在Taq DNA聚合酶单独作用下以双链RNA为模板进行PCR反应的条件。结果表明靶序列长度为277 bp、369 bp、987 bp时,均可直接进行PCR扩增;短片段序列扩增的退火温度在47．0℃、47．9℃、50．2℃、52．6℃、54．9℃、56．7℃条件下,均可有效扩增,而长片段序列扩增的退火温度在50．2℃、52．6℃、54．9℃、56．7℃条件下,也可扩增出相应的靶序列。这一结果提示利用Taq DNA聚合酶可以dsRNA为模板直接扩增目的片段,尤其是短片段的扩增。

侵染蚕豆的双链RNA病毒的克隆及其功能分析

在自然感病的蚕豆中检测到2条主要dsRNA条带(dsRNA1和dsRNA2),采用改进的单引物扩增法(modified single primer amplification technique,M-SPAT)获得其全长cDNA,克隆测序后,与GenBank中的已知序列进行分析比对,结果显示:它们编码的蛋白分别与已经报道的野豌豆潜隐病毒(Vicia crypticvirus,VCV)的复制酶(RNA-dependent RNAploymerase,RdRp)和外壳蛋白(capsid protein,CP)的相似度分别为99%和100%。序列进化树分析进一步表明:dsRNA1与dsRNA2组成野豌豆潜隐病毒中国分离物的基因组。

双黄连粉针剂治疗艾滋病的临床观察

为了寻求一种物美价廉的行之有效的药物治疗艾滋病。我们采用哈尔滨中药二厂生产的双黄连粉针剂抗病毒治疗为主，辅以其他的对症治疗，对１５例已确诊的艾滋病病例患者进行了治疗和观察。经过４周的治疗，１５例患者中有１４例临床症状明显好转，症状缓解率高达９３３３％，１５例艾滋病患者治疗前ＣＤ＋４Ｔ淋巴细胞为７９３３±７９２４，治疗后增加为１５０２７±１４４５７（Ｐ＜００５），说明双黄连粉针剂可以在短时间之内提高艾滋病患者的ＣＤ＋４Ｔ淋巴细胞。１５例患者经过治疗后血红蛋白和体重均有增加。治疗结束时，１５例患者均未发现肝肾损害及其他的不良反应。说明双黄连粉针剂对艾滋病的治疗有比较明显的疗效，且毒副作用少，可以在临床中推广应用。

两种半夏根部致病菌的比较研究

2018年春夏,贵州省遵义市发生三叶半夏(Pinellia ternata)根部病害,叶柄以上部位倒伏,且连片快速发生。为明确其病原菌,对自然发病的半夏病株进行了病原菌的分离,并对获得的主要病原菌进行形态学观察、16S rDNA序列鉴定和致病性测定。结果表明,当地发生的半夏病害主要由2种病原菌引起:(1)胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)引起半夏叶柄以上部位水渍状快速软烂倒伏,伴随发臭;(2)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起半夏叶柄基部折断,植株干枯黄化,连片倒伏,但单株发病进程相对较慢。这是首次有关铜绿假单胞菌引起半夏根部病害的报道,建议将其引起的病害称之为“半夏黄化猝倒病”。在人工接种条件下,铜绿假单胞菌YD-01寄主范围较窄,但能侵染番茄果实;而胡萝卜果胶杆菌RD-02可以侵染莴苣、青椒、茄子、土豆、番茄和梨等果实,并产生明显软腐症状。利用BioF型间歇浸没植物生物反应器建立植物-微生物共培养模型,结合盆栽试验分析2种病原菌导致的病情指数和病程指标变化,进一步确定了其差异。本研究结果为半夏根部病害防控提供了新的直接依据。

黄瓜花叶病毒萝卜分离株卫星RNA的克隆及其与12个卫星RNA核苷酸序列的比较

对一株分离自萝卜 ( Raphanus sativus)的黄瓜花叶病毒 ( CMV)卫星 RNA( Rs)进行了 c DNA克隆与序列确定 ,并与 12个已知的卫星 RNA序列进行了比较 .结果表明 :卫星 RNA Rs的大小为 368nt;该卫星 RNA所比较的 13个卫星 RNA的大小分布为 334～ 4 0 5nt,可分为 3个组和 4个亚组 ;CMV卫星 RNA的序列同源性和分组与卫星 RNA的大小并无直接联系 .卫星 RNA序列之间的连续缺失和插入均集中在 90～ 2 55nt间几个邻近的区域 .在卫星 RNA二级结构中的非配对区序列、卫星 RNA的 5'端近 80个碱基和 3'端近 4 5个碱基相当保守 .由此推测 CMV卫星 RNA的理论长度可达 4 4 6nt.序列结构的比较显示 ,CMV卫星 RNA具有作为外源基因载体的潜力 .

系统侵染寄主中黄瓜花叶病毒及其卫星RNA的动态变化

以3 2 P标记的黄瓜花叶病毒 (CMV)RNA3cDNA片段和卫星RNA全长cDNA作为探针 ,定量测定CMV基因组RNA和卫星RNA的含量变化 ,结果显示 :二者均具有明显的寄主效应和时间效应 .在 16～ 2 0℃条件下 ,接种不携带卫星RNA的分离物CMV R3,15天、 30天和 75天时 ,CMV基因组RNA负荷量呈显著下降的趋势 .在第 15天 ,RNA3的负荷量以烟草 >心叶烟 >克里夫兰烟 >番茄的顺序表现为不同寄主的显著性差异 .相同条件下接种携带高拷贝卫星RNA的分离物CMV RS ,在 5天和 15天之间基因组RNA和卫星RNA负荷量均呈现上升的趋势 ,同时测得其基因组RNA和卫星的负荷量具有相似的寄主效应和时间效应 ,但程度不同 .第 15天时 ,二者负荷量以烟草 >心叶烟 >番茄的顺序表现寄主效应的显著性差异 .在 18～ 2 1℃条件下 ,接种携带坏死卫星RNA的CMV强毒株HC4 ,第 5天、第 10天和第 15天时 ,基因组RNA和卫星RNA的负荷量均以番茄>心叶烟 >烟草的顺序表现出显著性差异 ,并表现出明显的时间效应 .

引起掌叶半夏花叶病的芋花叶病毒

在表现花叶症状的天南星科药用植物掌叶半夏（Ｐｉｎｅｌｉａｃｏｒｄａｔａ）上检测到一种线状病毒，病毒粒子的最大分布范围为７２５～７７６ｎｍ，平均长度为７４５ｎｍ。提纯病毒Ａ２６０／Ａ２８０为１．２８，电镜下观察为均一的线状病毒粒子。经免疫电镜测定该线状病毒与芋花叶病毒（ＤＭＶ）抗血清有强的阳性反应。在病叶横切面的细胞质里观察到具风轮状、卷筒状和片层状聚集结构，在纵切面上为束状的细胞质内含体以及分散的和紧密聚集的线状病毒粒子。寄主反应测定结果表明，该病毒侵染天南星科植物，不侵染其它１１科３５种非天南星科供试植物。据上述试验结果，该病毒分离物认为属芋花叶病毒。

九种Potyviruses柱状内含体结构的比较研究

通过寄主叶肉细胞超薄切片的透射电镜观察，对马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ）、芋花叶病毒（ＤＭＶ）、大蒜黄条病毒（ＧＹＳＶ）、大豆花叶病毒（ＳＭＶ）、蚕豆叶卷花叶病毒（ＰＬＲＭＶ）、芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）、大丽菊上的马铃薯Ｙ组病毒（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ－Ｄｈ）、莴苣花叶病毒（ＬＭＶ）和大麦黄花叶病毒（ＢＹＭＶ）九种病毒共１２个病毒分离物所产生的柱状内合体的结构进行了比较研究。结果表明同一病毒的不同分离物所产生的柱状内合体在横切面上的形态有明显差异，风轮状结构的外臂与卷筒状结构和片层状聚集体可以相互转化。将所得结果与Ｅｄｗａｒｄｓｏｎ等（１９６６，１９８４）所划分的柱状内含体的４个型进行了比较并探讨了柱状内含体在Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ分类、鉴定和病害诊断方面的意义。

我国13种天南星科作物上的芋花叶病毒

用直接负染和免疫电镜方法从我国浙江省(杭州、奉化、温州等地)、上海、北京、福建、湖南等地的13种天南星科大田作物:芋(Colocasia esadenta)、魔芋(Amorphophallus sinesis)、药用植物:半夏(Pinellia ternata)、掌叶半夏(P. cordata)、盾叶半夏(P. pedatisecta)以及观赏植物:马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、海芋(Alocasia macrorrhiza)、象耳芋(Colocasia gigantea)、台果芋(Syngonium podophygum)、黄金葛(Scindapsus aureus)、广东万年青(Aglaonema modestum)、花叶芋(Caladium bicolar)、剑叶喜林芋(Philodendium oxycadium)上均检测到芋花叶病毒(Dasheen mosaicvirus, DMV)。在免疫吸附-免疫修饰电镜水平上,该病毒与DMV抗血清和PVY抗血清均有强阳性反应。在人工接种条件下,DMV各分离物均不侵染烟草等非天南星科供试植物,但接种天南星科指示植物Philodendron selloum、半夏和掌叶半夏均表现系统症状。受DMV自然感染的天南星科作物叶中,病毒粒子的平均长度为752nm,病毒粒子的最大分布范围为667～882nm。从感病植物叶组织超薄切片中观察到紧密聚集和分散的线状病毒粒子和典型的Potyvirus柱状内含体。内含体同时具有风轮状(Pinwheel)、卷筒状(Scroll-like)和片层状聚集体(Laminated aggregate)。

侵染番红花的芜菁花叶病毒

从表现花叶症状的德国进口番红花上获得一线状病毒分离物SA,线状病毒粒子长度为700～800nm。其在人工接种的11科39种植物中能侵染6科14种植物,在克里芙兰烟上产生系统坏死,在小白菜、花椰菜等十字花科植物上产生系统花叶或为隐症,在昆诺藜等藜科植物上为局部侵染。在番红花病叶、球茎及克里芙兰烟病叶组织中观察到卷轴状和片层状聚集的风轮状内含体。免疫吸附和免疫修饰电镜观察结果显示,SA与芜菁花叶病毒((TuMV)具有紧密的血清学关系。根据这些特征将SA鉴定为TuMV的一个分离物。这是TuMV侵染番红花的首次报道。

甘蓝型油菜芜菁花叶病毒分离物TuMVH_1的生物学研究

采自杭州甘蓝型油菜上的芜菁花叶病毒分离物ＴｕＭＶＨ１，经寄主反应测定，不侵染茄科普通烟和心叶烟，对多数供试甘蓝型油菜和十字花科蔬菜品种（品系）有强的致病力。枯斑指示植物检测和ＥＬＩＳＡ检测，选择城青２号大白菜作为毒原繁殖寄主，提纯病毒的得率为６—７ｍｇ病毒／１００ｇ鲜病叶，用提纯病毒制备的免抗血清经环状沉淀反应测得其效价为１／２００００，免疫电镜观察，ＴｕＭＶＨ１与同源抗血清有强的阳性反应，与另一个芜菁花叶病毒抗血清亦有阳性反应。提纯病毒经蛋白酶Ｋ处理，酚：氯仿抽提后在琼脂糖凝胶电泳中测定其ＲＮＡ分子量约为９．４ｋｂ。在接种ＴｕＭＶＨ；３０天的城青２号大白菜和甘蓝型油菜的植株细胞中观察到分散的线状病毒粒子和典型的风轮状内含体。ＴｕＭＶＨ１风轮状内含体的结构介于Ｅｄｗａｒｄｓｏｎ等所描述的亚型和Ⅳ型之间。

美人蕉黄瓜花叶病毒研究

美人蕉黄瓜花叶病毒研究陈集双，吴林福，周雪平，李德葆（浙江农业大学生物技术研究所，杭州３１００２９；中国水稻研究所植保系，杭州３１０００６）ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｕｃｕｍｂｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓＩｎｆｅｃｔｉｎ...

几种天南星科植物受芋花叶病毒感染后的叶片组织病变研究

对自然感染芋花叶病毒（ＤＭＶ）的几种天南星科植物的叶片超微结构进行电镜观察的结果表明：ＤＭＶ感染天南星科植物同时形成风轮状（Ｐｉｎｗｈｅｅｌ）、卷筒状（Ｓｃｒｏｌｌ－ｌｉｋｅ）和片层状聚集体（ｌａｍｉｎａｔｅｄａｇｒｅｇｇａｔｅｓ）结构的细胞质内含体（即柱状内含体，ＣｙｌｉｎｄｅｒｉｃａｌＩｎｃｌｕｓｉｏｎ，ＣＩ）。ＤＭＶ所产生的细胞质内合体与Ｅｄｗａｒｄｓｏｎ等所划分的Ⅱ型ＣＩｓ相符。在叶肉细胞质中还观察到分散的病毒粒子、大量紧密聚集的病毒粒子以及主要由病毒粒子组成的类似病毒包含体（Ｖｉｒｏｐｌａｓｍａ）的结构。同时，不同寄主来源对ＤＭＶ细胞质内含体的形状有明显影响：来源于自然感病的马蹄莲细胞中ＣＩｓ横切面上主要是风轮状结构组成；在芋、广东万年青的感病细胞中亦是以风轮状结构占优势，但具有一定数量的片层状结构和卷筒状结构；在魔芋、半夏和海芋的细胞中则以卷简状结构为主，具有一定数量的片层状结构，有的甚至完全不形成风轮状．

添加卫星RNA对黄瓜花叶病毒寄主反应及其在系统寄主中含量的影响

为了解卫星RNA(satRNA)对辅助病毒在系统寄主中的直接影响,将1株黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)的卫星RNA(satRNA)sat-Yi与本身不携带卫星RNA的CMV分离物CNa在体外进行假重组,获得了人工构建的假重组毒株CMV-NY。通过寄主反应测定、双链RNA分析和全序列分析,显示satYi与CMV-CNa基因组RNA能够稳定共存,经过反复转接也没有发现卫星RNA的序列突变。通过测定CMV-CNa和NY这2个病毒株的寄主反应,发现satRNA-Yi的存在明显延迟了CNa在所有供试寄主中的发病时间,而且明显减弱了其在多数供试寄主上的症状表现,其中在葫芦科植物上表现出减轻症状的效果最明显;用一种新建的核酸玻片杂交方法,定量测定寄主植物中CMV基因组CP基因及卫星RNA的相对含量变化,结果显示:26℃条件下,在接种5、10、15、20、25和30d的心叶烟中,2个毒株的CP基因含量都呈下降趋势,在相应的时间内,NY-CP基因在同一寄主中的含量均低于CNa-CP基因的含量;接种10d,NY与CNa的寄主适应性没有显著差异,二者基因组CP基因在6种寄主植物中的相对含量均为番茄>假酸浆>心叶烟>西葫芦>南瓜>曼陀罗。由此得出以下结论:sat-Yi降低了CMV CP基因在寄主中的含量,且随着接种时间的增加,卫星RNA的影响作用越明显;sat-Yi不改变CMV基因组RNA的寄主适应性,但是通过降低CP基因含量改变其症状特征。

黄瓜花叶病毒猖獗与气候变暖关系及其对策

黄瓜花叶病毒(CMV)可经60多种蚜虫传播,侵染1000多种植物,近15年来其危害日渐严重,目前已成为我国发生最普遍、危害最严重的植物病毒。从生物学角度分析了黄瓜花叶病毒的发生猖獗与气候变暖的关系,并提出了依靠农业措施和生物防治手段进行病害控制的对策。

苜蓿花叶病毒提纯方法的改进

用来自于白车根草 (Trifolium repens)上的一个苜蓿花叶病毒分离物 AMV- SY为材料 ,比较了 3种以差速离心为主结合 PEG沉淀和超速离心提纯病毒的方法 ,对提纯病毒进行紫外吸收测定、电镜检查和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果显示 :以交替使用含有 0 .1mol/LEDTA和 0 .1mol/L Mg SO4 的磷酸缓冲液作为病毒悬浮介质的提纯程序最为理想。该方法提取苜蓿花叶病毒的得率为 4 7.6 mg/10 0 g昆诺藜鲜病叶 ,该病毒分离物的外壳蛋白分子量为 2 9k D。该方法的病毒得率较高、杂蛋白较少、病毒粒子完整 ,是比较理想的提纯方法。

葱兰黄化病病原类菌原体的研究

葱兰为石蒜科(Amaryllidaceae)草本植物,是一种在我国各地普遍栽培的多年生观赏花卉.葱兰黄化病是1992年在杭州发现的一种新病害,该病对葱兰的生长和观赏价值有严重影响.罹病株(丛)最初表现为深红色斑点,逐渐扩大为鲜红色条斑或斑块并转为亮黄色,最后整株叶片大部分转为鲜艳的黄色,呈现典型的系统侵染.发病1—2月后整株(丛)地上部分枯死.发病一般始于早春(3月上旬),春末夏初有一个发病高峰期;秋末有另一个发病期,但病状较轻;感染株有恢复现象,即在下一个生长季能从地下部分重新生长出叶片,但病株叶片明显细小,有丛簇现象,病株开花少且花期短.作者从1992年春起,对该病害进行了病原分离、生物学测定和病组织超薄切片电镜检查,发现该病害可能与类菌原体有关,现将研究结果报告如下.1 材料和方法1.1 样品感病植株分别于1992年4月采自浙江农业大学校园和1992年6月采自杭州花圃,用盆栽保存于防虫温室中,同时采取健株作为对照.1.2

侵染半夏的两种病毒的分离纯化和初步鉴定

用自然感染的半夏（Ｐｉｎｅｌｌｉａｔｅｒｎａｔａ）为材料，经粗提纯后检查到一种线状病毒和一种球状病毒，用两种方法对担提纯样品中的病毒粒子进行了分离纯化。１０％－７０％连续甘油梯度８００００ｇ离心１５０分钟获得两条病毒带，经紫外吸收测定均为强的核蛋白吸收峰，病毒粒子检查分别为球状和线状病毒粒子，线状病毒经浓缩收集为均一成份．与芋花叶病毒（Ｄａｓｈｅｅｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＤＭＶ）抗体有强的阳性反应。粗提纯样品经０．８％琼脂糖凝胶电脉分离为一条蛋白带，该条带回收后经紫外吸收测定为核蛋白吸收峰，电镜下检查为均一的球状病毒，以ＴＭＶ为对照、醋酸铀（ＵＡＣ）负染后测得该球状病毒（ｐｉｎｅｌｌｉａｓｐｈｅｒｉｃａｌｖｉｒｕｓ１．ＰｓＶ－１）的大小为３１．７ｎｍ；戊二醛固定后磷钨酸（ＰＴＡ）负染测得ＰｓＶ—１的大小为３４．０ｎｍ。各组分经ＳＤＳ－聚丙烯酸胺凝焦电泳分析测得线状病毒和球状病毒的外壳蛋白分子量分别为２０ＫＤ和２８ＫＤ。初步确定线状病毒为ＤＭＶ．球状病毒ＰｓＶ—１为侵梁天南星科半夏的一种新病毒。