新型Smad7重组腺病毒载体的构建

目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7)。方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-Smad7,线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组,鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7。RT-PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况。结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3 d可观察GFP明显表达;RT-PCR检测证实Smad7表达增强。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7,为进一步研究TGFβ信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础。

单味生大黄对实验性肝纤维化的影响

目的观察中药生大黄对实验性肝纤维化的影响并探讨其可能的作用机制。方法四氯化碳皮下注射法制备大鼠肝纤维化模型,分别给予不同剂量的生大黄悬浮液灌胃,酶试剂法测定肝功能,放免法测定细胞外基质(extracellular matrix ,ECM),HE、VG 染色和电镜检测病理形态学改变。结果生大黄治疗组大鼠肝功能状态有不同程度改善,ECM 含量有所下降,肝纤维化程度降低,以大剂量组较为显著。结论大黄可保护肝细胞,抑制 ECM 合成,具有防治实验性肝纤维化和肝硬化的作用。

灌胃给药时粉防己碱对雄性SD大鼠的急性毒性实验研究

目的:观察粉防己碱在灌胃给药时对雄性SD大鼠的急性毒性反应。方法:按倍比稀释法将粉防己碱配制成不同浓度的混悬液。雄性SD大鼠随机分组,分别以不同剂量的粉防己碱灌胃,灌胃后连续观察7d,记录急性毒性反应。采用Bliss几率单位法计算半数致死量。结果:灌胃给药时,粉防己碱对雄性SD大鼠的半数致死量为646mg/kg,其95%平均可信限为504.58～788.42mg/kg。结论:粉防己碱具有中等度毒性,在基础研究和临床应用中应注意控制其用药剂量。

8型腺相关病毒介导短发夹状RNA在小鼠肝脏的表达及其功能

目的以内源性基因超氧化物歧化酶1(SOD1)为靶基因,观察经单次尾静脉注射后8型腺相关病毒(AAV8)介导的短发夹状RNA(shRNA)在小鼠肝脏内的表达、对靶基因的沉默效应以及重组AAV8-SOD1 shRNA的副反应。方法利用AAV8载体系统的双启动子构建能同时表达绿色荧光蛋白(GFP)和SOD1 shRNA的重组AAV8-SOD1 shRNA。采用Northern blot和Western blot分别检测SOD1shRNA在小鼠肝脏内表达水平、靶基因SOD1在mRNA和蛋白水平表达变化、肝细胞微小RNA122(miRNA-122)表达水平;标准酶法测定小鼠肝功能;酶联免疫实验测定干扰素-α(IFN-α)水平;经HE染色对肝组织进行病理学观察。结果经尾静脉注射重组AAV8-SOD1 shRNA后,小鼠肝组织中可检测到SOD1 shRNA和SOD小干扰RNA(SODsiRNA)反义链的表达;靶基因SOD1在mRNA和蛋白水平表达均明显受抑;血清转氨酶轻度升高,但IFN-α水平无上调;肝组织无明显病理学改变;肝细胞miRNA-122水平无明显下降。结论经尾静脉单次注射重组AAV8-SOD1 shRNA后,SOD1 shRNA后可在小鼠肝脏中高效表达并沉默靶基因表达。重组AAV8-SOD1 shRNA对小鼠机体无明显副反应。

Smad7基因过表达对L02肝细胞株增殖的影响

目的观察外源Smad7基因对L0 2肝细胞株增殖活性的影响。方法分别以重组腺病毒AdSmad7和对照病毒AdGFP在体外感染L0 2肝细胞 ,以RT PCR和Western blot检测外源Smad7基因表达情况 ,MTT法检测L0 2肝细胞增殖活性 ,流式细胞仪检测其细胞周期变化。结果AdSmad7体外感染L0 2肝细胞后 ,Smad7mRNA和蛋白水平均显著上调。转化生长因子 β(TGFβ)可抑制L0 2细胞增殖 ,诱导其凋亡。导入外源Smad7可拮抗TGFβ的作用。结论利用AdSmad7导入外源Smad7基因可间接促进肝细胞增殖 。

Smad7和组织器官纤维化

转化生长因子 β(TGF β)在组织器官纤维化发生过程中起关键作用。Smad7是TGF β信号转导途径的主要抑制性蛋白 ,其异常表达可影响TGF β活性 ,进而改变纤维化进程。

非酒精性脂肪性肝病的无创伤性诊断

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）及遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，其疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及其相关肝硬化。随着国人生活习惯和饮食结构的改变，近十年我国NAFLD患病率增长迅速，上海、广州等发达地区普通成人NAFLD的患病率现已高达15％^[1]。尽管80％以上的NAFLD为单纯性脂肪肝，影响患者预后的主要因素是糖尿病、

血小板源生长因子调控肝星状细胞增殖的机制

血小板源生长因子具有促进肝星状细胞增殖的作用,其详细机制不明,可能涉及到血小板源生长因子与其受体结合后进一步影响三磷酸肌醇激酶、钙通道、信号转导及转录活化蛋白、细胞外信号调节激酶、磷脂酶C-γ1及钠-氢交换等。

外源Smad7基因对四氯化碳诱导大鼠实验性肝纤维化的影响

目的研究外源Smad7基因对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠实验性肝纤维化的影响。方法将40只雄性SD大鼠随机分为4组。第一组为正常对照组,其余3组采用CCl4皮下注射法建立大鼠肝纤维化模型,并在实验第2周和第4周分别经尾静脉导入生理盐水、重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7或对照病毒AdGFP。标准酶法测定各组大鼠肝功能情况;放射免疫法测定血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)水平;RT-PCR法检测大鼠肝组织Smad7 mRNA表达。免疫组织化学法测定α-肌动蛋白(α-SMA)、Smad7表达;肝组织切片采用HE和VG染色进行肝纤维化程度分级。结果与模型对照组相比,AdSmad7导入组大鼠血清谷丙转氨酶(GPT)和碱性磷酸酶(AKP)水平有不同程度的降低,GPT降低更明显;血清PCⅢ和LN水平也显著下降(P<0.05)。RT-PCR和免疫组织化学染色证实,AdSmad7导入组大鼠肝组织Smad7表达显著上调,而α-SMA表达则明显下降(P<0.05)。病理学检查显示:AdSmad7导入组大鼠肝组织结缔组织增生程度减轻,纤维间隔变细,假小叶形成不明显,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05)。结论重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7经尾静脉注射后可在大鼠肝组织中表达;外源Smad7基因可改善纤维化大鼠肝功能,降低血清PCⅢ水平,下调α-SMA表达,减轻大鼠肝纤维化程度。

粉防己碱上调Smad7表达抑制大鼠肝星状细胞活化

目的观察低浓度粉防己碱(Tetrandrine,Tet)对培养的大鼠肝星状细胞(HSC)活化和转化生长因子β1(TGFβ1)促活化作用的影响,并探讨该作用与TGFβ1受体后信号通路的关系。方法HSC原代培养,给予Tet(0.4、0.8、1.6和3.2μmol·L-1)处理,免疫细胞化学法检测α平滑肌肌动蛋白(αSMA)表达,或给予TGFβ1(质量浓度5μg·L-1)和(或)Tet(1.6μmol·L-1)干预,分别以RTPCR和Westernblot法检测TGFβ1及其Ⅰ、Ⅱ型受体、Smad3、Smad7以及αSMAmRNA和(或)蛋白表达。结果Tet(0.4～3.2μmol·L-1)能抑制培养HSC表达αSMA。Tet(1.6μmol·L-1)抑制TGFβ1诱导的HSCαSMA表达,伴有Smad7表达上调及TGFβ1表达下降,但不影响TGFβⅠ、Ⅱ型受体和Smad3表达。结论低浓度Tet抑制培养HSC的活化和TGFβ1促活化作用,该作用与上调Smad7表达并抑制TGFβ1有关而不影响TGFβ受体表达。

氧化苦参碱对转化生长因子-β_1促肝星状细胞活化及跨膜信号转导影响

目的 观察低浓度氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞 (HSC)培养活化和转化生长因子 - β1 ,(TGF - β1 )促活化作用影响 ,并探讨该作用与TGF - β1 受体后信号通路的关系。方法 原代分离培养 2dHSC ,MTT法检测低浓度氧化苦参碱 (0 .2 5～ 8mg/L)对HSC细胞毒作用 (作用 12h)和增殖影响 (作用 48h) ,或给予TGF- β1 (5ng/ml)和 /(或 )氧化苦参碱 (2mg/L)干预 ,相差显微镜观察HSC形态变化 ,分别以RT PCR或Westernblot法检测TGF - β1 及其Ⅰ、Ⅱ型受体、Smad 2 /3、Smad 7以及α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA)mRNA和 /(或 )蛋白表达。结果 氧化苦参碱 (0 .2 5～ 8mg/L)对HSC无明显细胞毒作用 ,大于 8mg/L能抑制HSC增殖。氧化苦参碱 (2mg/L)抑制TGF β1 诱导HSC激活时的α SMA表达和形态转化 ,伴随TGF β1 受体mRNA表达升高 ,Smad 7mRNA表达上调及TGF - β1 mRNA表达下降 (与单纯TGF - β1 处理组相比 ,分别上升 1.2 5、0 .87倍或下降 1.92倍 ,P均 <0 .0 5 ) ,但不影响TGF β1 Ⅱ型受体和Smad 3mR NA表达。Westernblot检测Smad 2 /3、Smad 7蛋白表达 ,与RT PCR结果相似。氧化苦参碱对单纯培养激活的HSC有类似作用。结论 低浓度氧化苦参碱 (2mg/L)上调Smad 7表达并抑制TGF β1 表达、上调TGF β1 Ⅰ型受体。

大黄素对鼠肝纤维化肝功能、层粘连蛋白及透明质酸的影响

以40％四氯化碳(CCl_4)给大鼠皮下注射制备肝纤维化模型,并以小、中和大剂量大黄素治疗,采用常规方法测定肝功能并通过放射免疫法测定血清层粘连蛋白及透明质酸含量。结果发现大黄素能改善肝功能并降低血清层粘连蛋白及透明质酸。

大黄素对肝纤维化大鼠血清透明质酸的影响

目的:研究大黄素对肝纤维化大鼠血清透明质酸的影响。方法:采用40％四氯化碳(CCl_4)给大鼠皮下注射制备肝纤维化模型,并以小、中和大剂量大黄素治疗,通过放射免疫法测定大鼠血清透明质酸。结果:大黄素组血清透明质酸显著低于模型组。结论:大黄素能降低肝纤维化大鼠血清透明质酸。

脂蛋白、钙拮抗剂对大鼠贮脂细胞的影响

目的观察脂蛋白、钙拮抗剂对大鼠贮脂细胞增殖、透明质酸及胶原合成的影响．方法通过ＭＴＴ法，透明质酸放射免疫分析法及３Ｈ脯氨酸掺入法测定了低密度脂蛋白（ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＤＬ）、钙拮抗剂尼卡地平（Ｎｉｃａｒｄｉｐｉｎｅ，Ｎｉｃ）和维拉帕米（Ｖｅｒａｐａｍｉｌ，Ｖｅｒ）及其联合应用对大鼠贮脂细胞（ｆａｔｓｔｏｒｉｎｇｃｅｌ，Ｆｓｃ）增殖、透明质酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ，ＨＡ）及胶原合成的影响．结果ＬＤＬ能促进ＦＳＣ增殖、ＨＡ及胶原合成，同时Ｎｉｃ及Ｖｅｒ对ＬＤＬ刺激引起的ＦＳＣ增殖、胶原合成有明显的抑制作用，但对ＨＡ的抑制作用不明显．结论ＬＤＬ参与ＦＳＣ的增殖及细胞外基质的合成。

汉防己甲素抗肝纤维化研究进展

汉防己甲素（又称粉防己碱；Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ；Ｔｅｔ）是从防己科千金藤属植物粉防己（ｓｔｅｐｈａｎｉａｔｅｔｒａｎｄｒａＳ．Ｍｏｏｒｅ）的块根中分离出的主要生物碱，其分子式为Ｃ３３Ｈ４２Ｎ２Ｏ６，化学结构属于双苄基异喹啉类．现代药理研究证实，Ｔｅ...

肝纤维化研究现状及展望

肝纤维化是以细胞外基质沉积为特征的创伤愈合过程。肝星状细胞是肝纤维化发生发展中的关键细胞。肝星状细胞活化受细胞因子和细胞内信号转导途径所调控 ,其活化过程中的相关调控因子是抗肝纤维化治疗的重要靶标。肝纤维化分子机制正在不断阐明 。

丙酮酸乙酯对实验性结肠炎大鼠结肠组织HMGB1表达及细胞因子的影响

目的:观察丙酮酸乙酯(EP)对实验性结肠炎大鼠结肠组织HMGB1表达及炎症因子的影响.方法:SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、EP治疗组,每组12只;模型组、治疗组大鼠用DSS溶液复制实验性结肠炎大鼠模型,观察各组实验大鼠DAI评分、大体形态学及组织病理学评分(HPS)改变,采用应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Westernblot)检测结肠组织HMGB1表达;酶联免疫吸附法检测细胞因子(TNF-α、IL-6)的含量.结果:DAI和HPS在DSS模型组中高于空白对照组(7.20±2.28vs0.45±0.16,13.60±0.72vs6.4±0.85,P<0.01),在空白对照组结肠组织中HMGB1低表达,但在模型组表达显著上调(P<0.01);模型组血清TNF-α、IL-6水平高于空白对照组(190.40±24.55vs43.65±8.79,238.75±26.58vs74.3±7.92,P<0.01);与DSS模型组相比,EP可以缓解大鼠体质量的减轻,减少腹泻及便血的发生,并且能够显著下调结肠组织DAI、HPS、HMGB1mRNA和蛋白的表达,下调血清TNF-α、IL-6水平(P<0.05).结论:HMGB1参与了实验性结肠炎大鼠的发病过程,应用EP治疗可有效抑制实验性结肠炎大鼠结肠组织HMGB1的表达,可以明显下调TNF-α、IL-6等促炎因子的水平,有助于减轻实验性结肠炎大鼠炎症反应.

腺病毒介导的人uPA体外转染大鼠骨髓源性肝干细胞的研究

目的评价携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染骨髓源性肝干细胞(BDLSC)的效率,在BDLSC中的表达及其对BDLSC增殖和分化的影响。方法利用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清病理条件培养液筛选和扩增BDLSC,采用荧光显微镜检测AduPA的转染效率,采用Westernblotting法检测uPA在BDLSC中的表达,采用MTT法和免疫细胞化学法分别检测转染AduPA的BDLSC的增殖和分化变化。结果随着MOI的增高,转染效率明显增高,当MOI为500时,转染效率达92.6±2.2%,转染3天后的人uPA在BDLSC稳定表达,且转染AduPA对BDLSC的增殖和分化无明显影响。结论BDLSC可能是一种良好的基因载体细胞,可携带uPA用于肝纤维化的治疗研究。