山东恙虫病立克次体生物学及免疫学性质的研究

本文报告了山东恙虫病立克次体人株生物学及免疫学性质的初步研究。所研究3株中的1株感染小鼠发病不典型,极少致死;另两株感染小鼠发病典型,小鼠呈规律性的死亡,易适应于鸡胚,对小鼠毒力LD_(50)为3.4。感染小鼠之IgG抗体出现于接种后的第13天,于接种后的第3～4周抗体水平达峰值。上述分离株与Karp毒株间存在较强的交叉保护作用。酶免疫染色血清学反应结果指出,与Gilliam株很一致,可能属Gilliam同一血清型。

山西恙虫病立克次体分型及其56-kD蛋白基因序列分析

作者在我国新发现的山西恙虫病疫区病人血液中分离出3株恙虫病立克次体，SXh951，Sxh952，Sxh953。为明确其分类地位．对其进行了血清型，基因型和56－kD蛋白基因的部分序列分析。用免疫荧光抗体染色法将病人血清抗体与Karp,Gilliam．Kato株抗原反应．结果显示山西株与Gilliam型一致；用来自56－kD蛋白基因的引物扩增后，分别用限制性核酸内切酶Hinfl，HaeⅢ．Hhal消化DNA片段的多态性（PCR／RFLP）显示山西3株基因型一致，但均与Karp，Kato，Gilliam株的电泳图谱不同，显示为一独有的PCR／RFLP基因型；对Sxh951株56-kD蛋白基因片段扩增产物（1．2kb）进行DNA序列分析后．根据所推导氨基酸序列，比较Sxh951株与三个标准株氨基酸序列的同源性，发现Sxh951株与Karp、Kato和Gilliam株均有明显差异。对此，本实验室正在进一步研究，以便进一步确定其分类地位。

应用不同单克隆抗体和扩增引物快速诊断立克次体的实验研究

用不同特异性的黑龙江斑点热立克次体（Rickettsialheilongjiangii）054株单克隆抗体（McAb）或PCR引物检测立克次体的结果表明：群特异性的mcAb2E1和mcAb4G2用微量免疫间接荧光抗体染法（MIIF）法可检测出文中所用各种斑点热立克次体（SFGR）：立氏（R．rickettsii）、康氏（R．conerii）、小蛛（R．akari）、派克（R．parkeri）、西伯利亚（R．sibirica）、澳大利亚（R．australia）和054株立克次体；F7单抗只能检测出R．rickettsii和054株立克次体。PCR扩增结果表明：引物Rt120和Rr120．2048p—1625n分别对恙虫病立克次体（R．tsutsug－amushi）和SFGR扩增出现388bp和523bp扩增带；Rr190．70p—602n和Rr190．4442—5664n两对引物扩增结果相同，即除R．tsutsugamushi外对Q热（C．burnetii）、SFGR、普氏（R．prowazekii）和莫氏（R．mooserii）均扩增阳性，分别为532bp和1222bp电泳带；引物Rpcs．977p—1258n则可扩增上述所有立克次体，电泳带381bp。这样，可在短期内同时检测和初步鉴定不同立克次体。

一株斑点热立克次体的病原学研究

自内蒙古自治区的草原革蜱（D．nuttalli）中分离到一株斑点热立克次体。用微量酶标染色方法进行血清学鉴定表明，系西伯利亚（Rickettsiaesibirica种血清型。G＋Cmol％含量为32.4％。对其核酸进行聚合酶链扩增／限制性核酸内切酶消化（PCR／RFLP）分析DNA长度多态性，分别引用立氏立克次体蛋白抗原基因Rr190序列作为扩增引物Rr190．70p～602n和Rr190．4442p～5664n，扩增后分别用Pst1和Rsal限制性核酸内切酶消化。其电泳图谱证明，该分离株的DNA多态图谱与R．sibirica完全一致。上述结果可确证该分离株为西伯利亚斑点热立克次体种，称内85011株即NM-8501。

我国斑点热立克次体生物学特性及分子流行病学研究

本研究为平战结合的基础研究。作者采用分子生物学方法证实了我国有三个斑点热立克次体(SFGR)种:西伯利亚(R.sibirica)种及其亚种和两个新种——黑龙江斑点热立克次体和内蒙古斑点热立克次体;在国际上首先证实了康氏立克次体株间差异性,在种水平上的分类鉴定获得成功;在我国首次从病人分离到SF-

晋南地区恙虫疾疫源地的发现及其动物流行病学特点

西省南部的翼城和绛县一带农区存在有恙虫病的自然疫源地,该地区连年有恙虫病病例发生。通过连续数年的调查发现,该地的恙虫病属秋冬型,每年九月下旬至十一月上旬为病例的发生高峰。主要疫源动物为大仓鼠(Cricetulustriton),在寄生于鼠类的节肢动物中,姬鼠纤恙螨(Leptotrombidiumapodemi)为绝对优势种,其数量约占当地恙螨科种类的93.2%,其季节消长与当地恙虫病的流行趋势一致,被认为是该地恙虫病流行的传播媒介。

立克次体脂肪酸图谱及其相似性判别

用气相色谱-质谱法分析了7株立克次体浓盐乙醚纯化物的脂肪酸成分,即R.prowazekii E株、R.conorii Simko株、R.rickettsii R株、R.sibirica Barbash株和246株、R.sinkiangensis Jinghe株以及R.heilungkiangensis 54株。所得脂肪酸色谱图中有近50个色谱峰,初步确认有以下16种:C_(11∶0)、2OH-C_(10∶0)、C_(12∶0)、2OH-C_(12∶0)、C_(13∶0)、C_(14∶0)、C_(15∶0)、3OH-C_(14∶0)、C_(16∶1)、C_(16∶0)、C_(17∶0)、C_(18∶2)、C_(18∶1)、C_(18∶0)、C_(19∶0)和C_(22∶0)。其中主要成分是直链饱和脂肪酸C_(16∶0)、C_(18∶0)及C_(14∶0)与不饱和脂肪酸C_(18∶1)、C_(18∶2)及C_(16∶1)。实验菌株脂肪酸图谱经改进的Kulik-Vincent相似系数法处理后,精河株和246株的相似系数为97.0%,54株和其他菌株的相似系数在81.6—94.6%之间。

四株斑点热群立克次体DNA同源性的初步研究

用缺口翻译法将斑点热群立克次体西伯利亚 246 株 DNA 和康氏 Simko株DNA标记^(32)P。分别与中国分离株黑龙江 054株和新疆精河株 DNA进行斑点杂交,以对国内两分离株基因组与北亚、康氏基因组同源性进行初步研究。结果显示,新疆精河株 DNA与西伯利亚246株DNA高度同源。与血清分类实验结果相吻合。黑龙江 054株DNA 与西伯利亚 246株 DNA和康氏 Simko 株 DNA的杂交阳性最低稀释度均低于阳性对照100倍以上。提示054株基因组与西伯利亚立克次体、康氏立克次体 Simko 株基因组存在较明显之差别。

犬埃立克体实验模型初步研究

将犬埃立克体标准毒株 ( Florida株 )体外细胞纯培养物和我国犬埃立克体病病犬血白细胞分别接种于 C3 H小鼠 ,接毒后 1 5d,经 PCR检测证实均感染成功。本试验为犬埃立克体病小动物模型的建立打下了基础。

斑点热群立克次体中国分离株rOmpA基因片段的克隆和序列分析

用Rr190.70p-602n引物扩增了斑点热群立克次体（spottedfevergrouprickettsiae，SFGR）中国分离株（BJ－90株、Ha－91株和HLJ－054株）及SFGR国际标准株西伯利亚立克次体（Rickettsiasibiricu）246株和派克立克次体（R.parkeri）的rOmpA基因片段，将PCR产物克隆入pGEM－T载体中，用双脱氧法进行序列测定，并与SFGR的rOmpA基因已知序列进行了比较。结果表明，SFGR国际标准株间rOmpA基因片段的核苷酸同源性为90.06%～96.62%，推定氨基酸的同源性为83.05％～94.35％，中国分离株与国际标准株及参考株rOmpA基因片段比较的结果发现：BJ－90株及Ha－91株与西伯利亚立克次体标准株的核苷酸同源性分别为99．06％和98．31％，推定氨基酸的同源性则为98.87％和96.61％，HL－93株和HLJ-054株与日本立克次体（R.japonica）核苷酸同源性较高，分别为96.62％和95.68％，推定氨基酸的同源性为92．09％和89．27％。在中国分离株内，BJ-90株和Ha－91株的核昔酸同源性高达99．20％，推定氨基酸的同源性为97．74％，HIJ－054株和HL－93株rOmpA基因片段的核苷酸及推定氨基酸的同源性分别为98.12％，94.92％。因此认为在中国广阔的地域内，除HLJ-054株和HL-93株可能为SFGR的新成员外。

黑龙江立克次体054株单克隆抗体对斑点热群立克次体抗原结合位点及特性的分析

本文利用三株黑龙江立克欢你054株（HLJ－054）的单克隆抗体对四株斑点热群立克次体西伯利亚种（R．s．）246株、精河株（JH－74），立氏立克次体（R.r．）R株及HLJ-054株进行了血清学反应，对其蛋白组成及单抗结合抗原特性等方面进行了研究。结果表明：JH-74林与246株在上述三个方面完全一致，不同于HLJ－054及R．r．R株；HLJ－054株与R．r．R株与三株单抗血清学反应高度交叉．但二者在蛋白组成及与单抗反应的抗原组成上均存在差异。该结果支持黑龙江立克次体054株为斑点热群立党次作的一个新成员。单抗F7针对的抗原结合表位为蛋白多肽；而单抗2E1、4G2结合的抗原表位可能为精蛋白。

恙虫病东方体47kDa蛋白基因部分片段的克隆与表达

目的 表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot) 4 7kDa保护性抗原蛋白。 方法 采用PCR方法 ,从OtKarp株基因组DNA中扩增出 4 7kDa蛋白基因片段 ,鉴定后将该片段克隆于原核表达载体 pBV2 2 0 ,构建成重组质粒pBV -4 7。用该重组质粒转化E coli,转化子在 4 2℃诱导表达并对其鉴定。结果 (1)获得长约 14 30bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知 4 7kDa基因序列相同 ;(2 )SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 4 0× 10 3 处有表达带 ;(3)经薄层扫描分析 ,目的蛋白占全菌蛋白的 19% ;(4)免疫印迹实验证明其具有免疫反应性。结论 获得了 4 7kDa基因片段 ,并在大肠杆菌中实现了表达 ,表达产物具有免疫反应性。

斑点热的实验室诊断技术研究进展

斑点热（spotted fever）是由斑点热群立克次体（spotted fever group rickettsiae，SFGR）中病原性立克次体引起的一组以急性发热和皮疹为按症状的疾病的总称，包括落基山斑点热、北亚热、纽扣热、立克次体痘和昆士兰热等。斑点热分布很广，遍布于南极洲之外的世界各大洲。近年来，一些新的斑点热病种不断涌现，如日本的东方斑点热、前苏联的Astrakhan热、以色列蜱传斑疹伤寒、非洲蜱传热、Hinders岛蜱传斑疹伤寒及其他一些尚未命名的斑点热。

斑点热群立克次体中国分离株HL-93和HLJ-054亲缘关系的研究

目的 通过斑点热群立克次体 (spottedfevergrouprickettsiae ,SFGR)rOmpA基因片段的序列分析对HL 93和HLJ 0 5 4的亲缘关系进行研究。方法 用PCR分段扩增rOmpA基因重复区后 1 9kb片段 ,PCR产物直接测序 ,用WinstarDNA分析软件包进行同源性比较、进化树分析及酶切位点的分析。 结果 HL 93株和HLJ 0 5 4株核苷酸及推定氨基酸的同源性均在 99%以上 ,在树形图上单独聚为一类。常用酶的酶切位点完全一致。结论 HL 93株和HLJ 0 5 4株为同一种SFGR ,建议均命名为黑龙江立克次体 ,但可能存在株间差异性。

微波微量免疫荧光检测斑点热立克次体方法的建立

目的 建立微波免疫荧光检测斑点热立克次体的方法。方法 通过微波促免疫荧光染色最佳时间、最佳火力的选择及微波免疫荧光方法与常规免疫荧光方法敏感性的比较。结果表明 :微波法反应速度快 ,只需 15min就可以观察结果 ,大大缩短了检测时间 ,提高了工作效率 ,并且两种方法在特异性上没有显著性差别。结论 我们认为微波免疫荧光方法是一种简便的、实用的快速检测立克次体的方法。

用种特异性聚合酶链反应检测普氏立克次体的研究

目的 建立特异敏感的快速检验普氏立克次体PCR检测方法 ,并能与莫氏立克次体相区分。方法 采用种特异性巢式PCR方法 ,进行实验室模拟检测。结果 以普氏立克次体的rpa14 /16基因为靶标设计了两对引物 ;该引物特异性实验表明仅普氏立克次体特异性片段可以扩增出来 ,其余相关立克次体均扩增不出 ,尤其可鉴别其同群的莫氏立克次体 ;敏感性测试结果可检测出 6 3fg的普氏立克次体DNA ,可检测出 0 0 5个鸡胚半数感染量 (CEID5 0 )的立克次体 ;对人工模拟的小鼠脏器研磨液、血液标本检测发现该法在血液标本中的检测敏感性下降 3～ 4个滴度。结论 我们建立的巢式PCR可快速检验普氏立克次体 。