Hedgehog信号通路在人肝癌细胞株中的表达及意义

目的探讨Hedgehog信号通路在人肝细胞癌细胞系中的表达及意义。方法采用半定量RT-PCR法检测PLC/PRF/5、HepG2及SMMC-7721肝癌细胞株中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、Gli2mRNA的表达;Western blot法检测PLC/PRF/5、HepG2及SMMC-7721肝癌细胞株中Gli2蛋白的表达。结果除Shh外,Ptch1、Smo、Gli1、Gli2mRNA在PLC/PRF/5、HepG2及SMMC-7721细胞中均有不同程度表达。其中,Ptch1、Smo、Gli1、Gli2mRNA在PLC/PRF/5及SMMC-7721细胞中的表达强度显著高于成人正常肝细胞,而Gli1mRNA在HepG2细胞中的表达量与正常肝细胞无明显差异;Gli2蛋白在成人正常肝细胞中几乎没有表达,在HepG2细胞中的表达也与正常肝细胞无明显差别,而在PLC/PRF/5及SMMC-7721细胞中,尤其是SMMC-7721细胞,Gli2的表达量异常增高。结论 Hedgehog信号通路的异常激活参与了肝细胞癌的发生发展过程,Gli2可能成为肝细胞癌重要生物学标志和生物治疗靶点。

小干扰RNA沉默MDRl基因对SMMC-7721肝癌细胞株多药耐药性的影响

目的将表达特异性的小干扰RNA（siRNA）导入肝癌耐药细胞，干扰多药耐药（MDRl）基因后，观察其对肝癌耐药细胞化疗敏感性的影响。方法使用浓度梯度法制作sMMC-7721耐阿霉素细胞株（SMMC-7721／ADM），阿霉素浓度从0．1～2．0ms／L；转染siRNA（浓度25、50、75nmo/L）沉默此耐药株MDRl基因；转染后24、48、72h用定量逆转录．聚合酶链反应（qRT．PCR）检测各组细胞MDRl的mRNA表达水平；siRNA（浓度50nmoVL）转染后48h，行噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞对化疗药物的敏感性，计算各药物的半数抑制浓度（IC50）和耐药系数（RI）；流式细胞仪（FCM）检测细胞对阿霉素（浓度0．2mg／L）的凋亡。Westernblot检测蛋白表达含量。结果SMMC-7721／ADM对阿霉素、5．氟尿嘧啶（5．Fu）、长春新碱、奥沙利铂的RI为25．43、68．32、39．17、18．31。siRNA转染沉默MDRl基因后，发现其对上述药物的RI为5．01、17．04、4．96、1．62；qRT．PCR发现其MDRlmRNA表达量显著降低（P〈0．05）；Westernblot显示其MDRl表达产物P—gp蛋白显著降低（P〈0．05）；FCM发现加入阿霉素后，其细胞凋亡指数显著大于沉默前（P〈0．05）。结论用siRNA沉默SMMC-7721／ADM的MDRl基因后，SMMC-7721／ADM对化疗药的敏感性显著增加。MDRl基因与SMMC-7721肝癌细胞的多药耐药性显著相关，可通过沉默其MDRl基因来提高耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

小干扰RNA沉默多药耐药相关蛋白基因2对人肝癌细胞HepG2多药耐药的逆转作用

目的检测小干扰RNA（siRNA）对肝癌耐药细胞株HepG2／阿霉素（ADM）多药耐药相关蛋白基因2（MRP2）及其蛋白产物的抑制作用，观察对多药耐药性的影响。方法使用浓度梯度法制作HepG2耐ADM细胞株（HepG2／ADM），ADM浓度从0．1～2．0mg／L；设计合成针对MRP2的siRNA小片段，转染HepG2／ADM耐药细胞，24h后通过实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应（RT—qPCR）和Westernblot检测siRNA对MRP2基因mRNA和蛋白的抑制效果；噻唑蓝（MTT）比色法观察抑制MRP2基因表达后，HepG2／ADM细胞对化疗药物的敏感性变化，并计算各药物的半数抑制浓度（IC50）。结果HepG2／ADM对ADM、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、长春新碱和奥沙利铂的IC50值分别为0．3204、3．8002、0．2014和0．1221；siRNA明显抑制了HepG2／ADM细胞MRP2基因mRNA和蛋白的表达（P〈0．05）；转染MRP2-siRNA后，HepG2／ADM细胞对ADM、5-Fu、长春新碱和奥沙利铂的IC50值明显减小，分别为0．1023、1．4417、0．0452和0．0268。结论用siRNA沉默MRP2基因能够逆转HepG2／ADM细胞对化疗药物的耐药性，MRP2基因与HepG2／ADM肝癌细胞的多药耐药性相关，可通过沉默MRP2基因提高耐药细胞对化疗药物的敏感性。