NADC30-like PRRSV和PCV2d共感染与继发感染PCV2抗体阳性断奶仔猪的致病性

为了确定近年来国内主要流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NADC30-like谱系与猪2型圆环病毒(PCV2d亚型)共感染与继发感染后对猪的致病作用,使用本实验室分离的NADC30-like谱系PRRSV与PCV2d毒株感染PCV2抗体阳性断奶仔猪。选取30只5周龄PCV2抗体阳性断奶仔猪,随机均分为6组,分别为PBS、PCV2、PRRSV、PCV2-PRRSV、PRRSV-PCV2和Co-PRRSV-PCV2感染组。记录各组临床指征(体温、体质量、临床症状和存活率);检测特异性抗体及TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10共4种细胞因子的变化;并对主要组织脏器的病理变化进行分析。结果显示,各感染组在感染PRRSV后均出现体温升高、体质量减轻、咳喘、腹泻、精神沉郁等临床症状;Co-PRRSV-PCV2、PRRSV-PCV2和PRRSV组表现出更为严重的肉样变和淋巴细胞浸润;先感染PCV2可以延迟PRRSV特异性抗体的产生;PRRSV组表现出高水平的TNF-α和IL-10;NADC30-like PRRSV与PCV2d共感染与继发感染PCV2抗体阳性仔猪会出现严重的临床症状和病理变化,PRRSV单感染同样表现出严重的临床症状但病理变化相对较轻。

HP-PRRSV重组新城疫病毒载体疫苗构建及小鼠免疫评价

高致病性猪繁殖与呼吸综合征(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)在中国已流行多年,国内疫苗主要以减毒活疫苗为主,能有效保护猪不受病毒侵害,但易与野外毒株重组,导致新的变异株出现,而灭活苗安全性好但是疫苗效价低,因此本研究旨在研制一种不会重组且安全有效的疫苗。本研究利用反向遗传技术将HP-PRRSV具有抗原活性的GP5蛋白序列插入到新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)载体,拯救稳定表达GP5的重组病毒。通过PCR、酶切、Western blot、间接免疫荧光(IFA)和毒力检测试验对重组病毒进行鉴定,结果表明,重组NDV rL-GP5_((LQ))拯救成功,能够稳定表达GP5蛋白。小鼠的疫苗免疫效果评价结果表明,重组NDV rL-GP5_((LQ))二免后14 d特异性抗体酶标检测450 nm吸光度值为0.47(P<0.01),中和抗体为1∶8(P<0.01),在小鼠体内能诱导有效的抗体表达。脾淋巴细胞增殖试验中rL-GP5_((LQ))组显著升高(P<0.01),说明rL-GP5_((LQ))能在体内诱导免疫应答,为防控HP-PRRS提供了新的疫苗候选和思路。

NADC30-like猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒的制备与鉴定

【背景】猪繁殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)可以造成怀孕母猪的繁殖障碍及仔猪的呼吸系统疾病,近年来,NADC30-like谱系PRRSV已成为国内的优势流行毒株。【目的】研制针对NADC30-like谱系PRRSV的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗。【方法】将PRRSV NADC30-like毒株编码GP5蛋白开放阅读框5(open reading frame 5,ORF5)、ORF6(编码M蛋白)分别连接至pFastBacTMDual载体P10和PH启动子下游多克隆位点,获得穿梭质粒pFB-30-ORF5及pFB-30-ORF6,酶切鉴定后,将ORF6基因插入到穿梭质粒pFB-30-ORF5 PH启动子下游,构建穿梭质粒pFB-30-ORF5-OPF6。将上述3种穿梭质粒分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选及PCR鉴定重组杆粒。再将获得的重组杆粒转染至SF9昆虫细胞,发现细胞病变后收获病毒液,继续盲传3代,在透射电镜下观察是否有病毒样颗粒。用第3代病毒液感染SF9细胞后,分别用GP5蛋白、His-tag、Flag-tag单克隆抗体作为一抗,通过免疫电镜、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)、Western blotting鉴定重组蛋白。【结果】成功构建了3种穿梭质粒pFB-30-ORF5、pFB-30-ORF6和pFB-30-ORF5-OPF6,酶切鉴定正确。通过蓝白斑筛选及PCR验证后获得重组杆粒,分别命名为Bacmind-30-ORF5、Bacmind-30-ORF6和Bacmind-30-ORF5-ORF6。重组杆粒感染SF9细胞120 h时出现明显的细胞病变,收获病毒液后,在透射电子显微镜可观察到大小为50 nm左右呈现球形结构的VLPs。免疫电镜可以观察到胶体金颗粒结合在VLPs周围;IFA结果显示实验组均出现了明显绿色的特异性荧光灶;Western blotting结果表明,3种VLPs均出现特异性条带,并与预期大小一致。【结论】制备了3种NADC30-like谱系PRRSV的病毒样颗粒,为针对PRRSV新谱系流行株疫苗的研发奠定了基础。