弧菌菌株发酵工艺初步研究

采用摇瓶培养和发酵罐培养并在不同培养时间测定菌液浊度和活菌数,为弧菌灭活疫苗生产工艺提供参数。研究结果表明,摇瓶培养装量以30%较为合适,培养基初始pH 7.5,发酵过程以不再控制为宜。初步确定了弧菌发酵培养工艺参数:弧菌菌株接种TSB,28℃摇瓶培养18～20 h,28℃种子罐通气搅拌培养12～14 h,28℃发酵罐通气搅拌培养12～14 h。

嗜水气单胞菌GYK1株培养基的优化

在营养肉汤培养基的基础上,经过一系列嗜水气单胞菌GYK1株培养试验,结果证明,成本价格较低的蔗糖、酵母膏可以代替葡萄糖、牛肉膏,从而降低培养基原料成本;添加少量的K2HPO4和微量元素溶液(Mg2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+)可明显提高培养液的活菌数;通过正交试验得到低成本、高得率的适合嗜水气单胞菌GYK1菌株生长的培养基配方,该培养基组成(g/L):蛋白胨10.0、酵母膏10.0、蔗糖15.0、K2HPO42.28;NaCl 5.0微量元素(硫酸镁0.1,硫酸亚铁0.04,硫酸锌0.00375,二氯化锰0.0021)。24 h摇瓶培养,菌液中的最高活菌数可达316×108cfu/mL,比营养肉汤培养基活菌数(151×108cfu/mL)提高100%以上。

哈氏弧菌EcGY020401优化培养

目的:为规模化制备弧菌疫苗提供相关数据。方法:利用摇瓶和小型发酵罐培养,通过平板计数测定培养菌液的活菌数。结果:哈氏弧菌(Vibrio harveyi)EcGY020401株最适盐度为20～25g/L,合适的pH为7.5～7.7,葡萄糖浓度最适浓度为2～5g/L,用TSB优化培养基:胰蛋白胨5g/L、蛋白胨15g/L、大豆蛋白胨3g/L、酵母膏1g/L、葡萄糖4g/L、磷酸氢二钾5g/L、氯化钠15g/L、pH7.5,培养EcGY020401菌株,可达2.95×1010cfu/mL;小型发酵罐培养,10h可达到生长最大值,菌液浓度为3.46×1010cfu/mL。结论:用优化TSB培养基,采用发酵罐培养弧菌,可降低成本,提搞培养效率。

草鱼肠道中香港海鸥型菌的选择性分离与鉴定

从广东省某市池塘采集商品规格(体重2 0～2 5kg)的草鱼(Ctenoharyngodonidellus),利用加有头孢哌酮的麦康凯琼脂培养基,对其肠道中细菌进行选择性分离与鉴定。结果显示,12尾草鱼的肠道中,5尾可分离到具有以下特征的细菌:两端生鞭毛,菌体弯曲似海鸥状,革兰氏染色阴性,过氧化氢酶、氧化酶、尿酶和精氨酸双水解酶阳性,还原硝酸盐,不发酵、氧化或同化葡萄糖、甘露醇等15种常见的糖醇类,细菌形态、生化特性与报道的香港海鸥型菌相似,阳性率为41 7%。但在肌肉中未分离到此菌。进行分离细菌的16SrRNA基因序列分析,与GenBank中登录的4株香港海鸥型菌序列的同源性为99 7%～99 9%。由菌的培养特征、形态特点、理化特性、16SrRNA基因序列分析等多元鉴定的结果表明,从草鱼肠道中选择分离的细菌为香港海鸥型菌。药敏实验结果表明,所分离菌株对奥格门丁和亚胺培南的敏感性与报道的香港海鸥型菌有一定区别。

大黄鱼假单胞菌病病原的分离鉴定及药物敏感试验

于2009、2010年分别从浙江温州南麂岛网箱养殖的患病大黄鱼体内分离出优势菌株ZSH和DHY10051103K,人工感染试验证实其为大黄鱼的病原菌,其半数致死量(LD50)分别为2.5×106、3.2×106CFU/mL。对分离菌株进行了形态、生理生化特性的测定及16S rRNA分子鉴定,结果显示:分离菌株为革兰氏阴性短杆菌,氧化酶阳性;利用柠檬酸盐和麦芽糖,降解硝酸盐,精氨酸双水解酶阳性,甲基红试验阴性,明胶酶阴性,鸟氨酸脱羧酶阴性;在16S rRNA系统发育树中,分离菌株与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)聚为一支,GenBank中序列登录号分别为HQ007288、GQ449379。由此可知,分离菌株属于恶臭假单胞菌(P.putida)。药物敏感性试验结果表明,分离菌株对强力霉素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、左旋氧氟沙星、氧氟沙星、阿米卡星、诺氟沙星、恩诺沙星、四环素等10种药物敏感;五倍子和石榴皮对其抑菌效果最好,MIC值分别为1.57、3.13 mg/mL,其次为黄连和黄芩,而大黄、白头翁、苦参、黄柏对其抑菌效果较弱。药物敏感性试验结果可以为大黄鱼假单胞菌病的防治提供参考。

哈维氏弧菌SpGY020601株的鉴定和生物学特性分析

SpGY020601株是从患溃疡病的红鳍笛鲷肝脏中分离出的1株致病菌。经形态学观察、生化特性分析和热激蛋白(HSP60)基因部分序列测定比较，确定该菌株为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。该菌株在人工注射感染时可致小鼠、斜带石斑出现急性死亡，对鲫有很强的毒性，半致死剂量(LD50)约为5.8×10^4CFU·g-1体重；培养液上清不溶解人O型血和小鼠红细胞，对斜带石斑、鲫红细胞也仅有微弱的溶血作用，具有淀粉酶、蛋白酶、明胶酶、脂肪酶活性，但不具有脲酶、卵磷脂酶活性；最适生长盐度为15-25，最适pH为7．2～7．8。同时还测定了该菌株在不同温度下的生长曲线；药物敏感性实验显示对喹诺酮类和复方新诺明等较为敏感。

鱼用哈维氏弧菌亚单位缓释微球口服疫苗的免疫效果初探

通过复乳化-溶剂挥发技术,采用生物可降解性高分子材料聚-DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)包裹哈维氏弧菌(Vibrio harveyi,Vh)重组外膜蛋白OmpK,制成缓释微球颗粒疫苗,口服免疫鲫鱼,测定其血清的凝集效价和相对免疫保护率.结果表明,制备的缓释微球疫苗直径＜10μm,且以粒径＜5μm的微球居多;微球中重组外膜蛋白OmpK包裹率达78.3%.鲫鱼口服微球疫苗2周后,血清抗体水平持续上升,第5周血清凝集抗体效价可达到与佐剂注射组相当的水平(28),抗体高峰期比注射组长1～2周,且降低较慢;免疫4周后用活菌攻击,口服组具有69.4%的相对免疫保护率,而对照组死亡率高达98%.结论为采用可生物降解的缓释微球作为鱼类亚单位口服疫苗的载体系统是可行的.

嗜水气单胞菌毒力因子检测及不同毒力基因型菌株对剑尾鱼的致病性研究

选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)的4种主要胞外毒力因子(气溶素、溶血素、胞外蛋白酶和细胞毒性肠毒)设计合成4对引物,对2008—2009年广东、江西两省的临床分离菌株进行检测,评价菌株毒力基因的分布特征及其毒力强弱。60株临床分离株中,具有4种毒力基因(aer+hly A+epa+act+)的菌株占58.33%(35/60),是主要毒力基因型;其他25株的毒力基因有不同数量缺失。不同基因型的代表菌株对剑尾鱼攻击试验结果表明,嗜水气单胞菌毒力因子之间表现出协同作用,aer+hly A+epa+act+型的毒力最强,对剑尾鱼的致死率最高。

两种多聚糖对彭泽鲫生长影响及免疫促进作用的初步研究

在彭泽鲫鱼种饲料中添加酵母细胞壁、β 葡聚糖、肽聚糖 (PeptidoglycanPG) ,添加量分别为 2g/kg、2 g/kg、2 0 0mg/kg ,饲养 6 0d。生长率及成活率与对照组无明显差异 ,仅略有提高。饲料中添加酵母细胞壁、β 葡聚糖、肽聚糖后均提高了血清溶菌酶活性 ,尤以 β 葡聚糖最为显著 ;酵母细胞壁、肽聚糖均能提高受免彭泽鲫凝集抗体效价 ,但 2种多聚糖对抗体形成动态影响有一定时差。肽聚糖能在更短的时间内提高血清凝集抗体效价 。

五条鰤源美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的分离鉴定及药物敏感试验

2007年5月广东汕尾红海湾网箱养殖的五条鰤爆发主要症状为脾脏、肾脏出现许多灰白色小结节的疾病。从病鱼体内分离出1株优势菌株,命名为SWZX5,为革兰氏阴性杆菌。SWZX5对剑尾鱼有强致病性,其半数致死量为5.8×105CFU/g。综合细菌在形态、生理生化特性及16S rRNA系统发育树等方面的研究结果,确认分离菌株SWZX5属于美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.piscicida)。15种中草药提取液的抑菌和杀菌试验显示,五倍子的功效最好,MIC和MBC均为0.05mg/mL;其次是黄连、石榴皮,两者MIC均为0.20 mg/mL,MBC均为0.40 mg/mL;黄芪功效较差。20种化学抗菌类药物的抑菌试验显示,分离菌株SWZX5对供试的氨曲南、恩诺沙星、左旋氧氟沙星、头孢呋辛钠等16种抗菌药物敏感;对卡那霉素、苯唑西林等4种抗菌药物中度敏感或耐药。

草鱼铜绿假单胞菌灭活疫苗发酵条件的优化

为优化铜绿假单胞菌JP802灭活疫苗菌液发酵及灭活条件。通过单因素试验对铜绿假单胞菌JP802摇瓶培养温度、pH、接种量、转速4因素进行了优化筛选,采用正交试验法对发酵条件的参数进行了优化,并进行了验证试验及5L发酵罐生长曲线;同时对铜绿假单胞菌JP802灭活疫苗发酵菌液灭活条件进行优化。试验结果表明,铜绿假单胞菌JP802株最适发酵条件为28℃,pH7.5,以10%接种量,转速270r/min,通气量4L/min,发酵培养12~14h。灭活条件优化结果表明在灭活温度为37℃条件下,福尔马林终浓度在0.40%,灭活48h即能完全灭活。通过对发酵条件的优化,可以获得更高产量的铜绿假单胞菌JP802发酵菌液。

水产源芽胞杆菌的分离鉴定及生物学功能分析

筛选具有较好生物学功能的芽胞杆菌(Bacillus),用以改善池塘养殖过程饲料等有机物降解、抑制水体中的病原菌,对从健康养殖鱼虾塘水体中分离的菌株,进行生化试验和16S rDNA序列分子鉴定;通过产酶、耐酸、耐高温试验,抑菌试验以及安全性试验研究分离菌株的生物学功能。试验共筛选出8株细菌,经生化试验及16S rDNA序列的分子鉴定,确定菌株ZHX17、ZHX18、ZHX31为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis),菌株ZHX14、ZHX15为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、菌株NSX4、NSX7、NSX9为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。试验结果表明,8株芽胞杆菌均具有较强的耐酸、耐高温特性,其中3株贝莱斯芽胞杆菌具有较强的分泌淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶的能力,抑菌效果好于其他5株芽胞杆菌。安全性试验结果表明8株芽胞杆菌对草鱼、罗非鱼相对安全。8株芽胞杆菌同时具备分泌淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶3种胞外酶的能力,其中贝莱斯芽胞杆菌具有较强的病原菌抑菌能力,可以作为病原拮抗益生菌做进一步研究。

微生物多糖对罗非鱼生长及非特异免疫功能的影响

在罗非鱼鱼种饲料中添加肽聚糖0 2g/kg、复合肽聚糖2g/kg、酵母细胞壁2g/kg、β-葡聚糖2g/kg;饲养60d后,观察测定了微生物多聚糖对罗非鱼生长及血清溶菌酶和补体替代途径溶血活性(ACH50)的影响。结果表明,酵母细胞壁、β-葡聚糖和肽聚糖对罗非鱼促生长作用不显著,复合肽聚糖有抑制生长作用。酵母细胞壁和β-葡聚糖均能提高血清溶菌酶活性,但对补体替代途径溶血活性无明显激活作用。

渔用疫苗发展现状及趋势

分析了国内外渔用疫苗产品研发与应用现状,目前全球超过140种疫苗获得生产许可,中国渔用疫苗相关研究涉及病原27种(类)。未来水生动物疫苗佐剂、抗原载体技术、规模化生产工艺和水产免疫基础等方面将成为研究热点,浸泡口服、多联多价疫苗及区域差异化免疫方案等将成为重要的技术需求,渔用疫苗将为水产动物疫病防治发挥重要作用。

一株斑点叉尾致病菌的分离鉴定

从斑点叉尾(Ictalurus punctatus)肝脏分离到的一株细菌GD091027,对该菌进行人工感染试验、生理生化特性测定和16S rRNA序列测定并构建系统发育树,同时进行了抗菌药物敏感性试验。结果显示:当人工感染剂量大于1.0×107 CFU/尾时,能引起斑点叉尾100%发病死亡,对斑点叉尾的LD50为6.2×104 CFU/g。分离株GD091027为革兰氏阴性短杆菌,氧化酶阴性,在25℃、35℃均有运动性,能耐3%的NaCl,不发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、D-甘露醇及L-阿拉伯糖,不利用西蒙氏柠檬酸盐,不利用丙二酸,赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶阳性,产生硫化氢和吲哚,甲基红(MR)试验阴性。在16S rRNA系统发育树中,该菌与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)聚为一分支。分离株GD091027对氨苄西林、庆大霉素、妥布霉素等16种抗菌药物敏感,利福平、青霉素等3种抗菌药物不敏感。除不产生溶血、不发酵葡萄糖和麦芽糖、甲基红(MR)试验阴性外,病原菌形态及生理生化特征符合迟缓爱德华氏菌,结合16S rRNA序列分析结果将其鉴定为迟缓爱德华氏菌。

草鱼铜绿假单胞菌灭活疫苗发酵培养基的优化及其在发酵罐的生长试验

为培养优质的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa菌液,通过单因素试验对草鱼铜绿假单胞菌灭活疫苗发酵培养基的氮源、碳源和磷酸盐成分进行了筛选,采用正交试验法对培养基各主要成分的用量进行了优化组合,并经过验证试验绘制出了铜绿假单胞菌JP802在优化培养基条件下的5 L发酵罐生长曲线。结果表明:草鱼赤皮病铜绿假单胞菌JP802发酵培养基中最佳氮源为蛋白胨+牛肉膏+酵母膏,最佳碳源为葡萄糖,最佳磷酸盐为磷酸氢二钾;确立了培养基的优化配方为蛋白胨10 g/L、牛肉膏5.0 g/L、酵母膏2.5 g/L、葡萄糖5.0 g/L、磷酸氢二钾0.75 g/L、氯化钠5.0 g/L,JP802菌株在此培养基中发酵14 h菌体浓度达到最大(OD_(600 nm)值为6.44)。研究表明,通过对发酵培养基的优化,可以获得更高产量的铜绿假单胞菌JP802发酵菌液。

鱼源嗜水气单胞菌疫苗生产菌株与分离株的抗原性分析

为分析商品化嗜水气单胞菌（Ah）败血症灭活疫苗生产菌株J-1与近年来分离的YYK090901菌株的抗原性是否存在差异,本研究应用western blot检测了抗J-1血清和抗YYK090901血清识别28株嗜水气单胞菌全菌蛋白情况,并通过细菌凝集试验测定了这2种抗血清与28株菌株的凝集效价。结果表明2种抗血清均能够识别25株菌株的大多数全菌蛋白,但识别GYK1、G060718-2L、Ah120606L 3株菌株的蛋白条带较少,2种抗血清识别同一株菌的全菌蛋白条带不完全一致。抗YYK090901血清对YYK090901、Ah120606L、JX120701具有较高的凝集价（211）,对J-1、GYK1等16株菌的凝集价为26~210,其中对J-1、GYK1的凝集价分别为27、210;对N-1-2、TTF20130613L等9株菌的凝集价较低,为24~25。抗J-1血清对1990s年和2012年~2013年分离的大部分菌株均具有较高的凝集价（211~212）,仅对GYK1、TTF20130613L等6菌株凝集价较低,为24~25。本研究结果表明,J-1与YYK090901的抗原性存在一定的差异。

一株维氏气单胞菌发酵培养基优化及其制备疫苗免疫效力比较

采用单因素试验、响应面试验法对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)发酵培养基的氮源、碳源、无机盐和磷酸盐成分及用量进行优化组合,确定优化培养基组成:胰蛋白胨10.8 g/L,葡萄糖5.0 g/L,牛肉膏3.0 g/L,磷酸二氢钾2.0 g/L,硫酸镁0.4 g/L,NaCl 5.0 g/L。并与基础培养基的发酵活菌数、制备的灭活疫苗免疫效力进行比较,经过验证试验绘制维氏气单胞菌在优化培养基条件下的7 L发酵罐生长曲线。在优化发酵培养基条件下,维氏气单胞菌活菌数为5.94×10^(9) cfu/mL,比基础培养基增幅43.13%;制备的灭活疫苗相对保护率为77.78%,比基础培养基提高了14.81%。7 L发酵罐发酵培养10 h,活菌数达到最大8.85×10^(9) cfu/mL。通过对发酵培养基的优化,可以获得低成本、优质高效的维氏气单胞菌发酵菌液,为今后维氏气单胞菌灭活疫苗规模化发酵培养提供参考。

区域微型生物养护剂对池塘环境改善作用研究

【目的】探讨区域微型生物养护剂在水产养殖中改善养殖生态环境的作用机理。【方法】在实验室内用水族缸建立4个模拟池塘生态环境,各处理的底泥、池水来源分别为:处理1和处理3来自南沙健康塘,处理2来自南沙非健康塘,处理4来自清远非健康塘,各引入鳙鱼(Aristichthys nobilis)3尾、罗非鱼(Oreochromis mossambicus)2尾、清道夫鱼(Pterygoplichthys multiradiatus)2尾,搭配合理的投饲管理,定期使用以南沙与清远当地池塘微生物及农业生产次产品制成的池塘微型生物养护剂(护料),观察护料对水质因子、浮游藻类、原生动物及鱼体的养护作用。【结果】使用护料对降低处理2及处理4的氨氮效果显著,并在模拟试验期间维持各处理的水质因子相对稳定。试验过程中,浮游藻类震荡增加,试验组比对照组增速快、变动幅度窄,第90天(D90)时平均密度、种类数及多样性指数分别依次为处理4>处理1>处理3>处理2、处理2>处理4>处理1>处理3、处理4>处理2>处理1>处理3,使用护料可将主要浮游藻类种类养护为绿藻门、硅藻门种类,并降低单一优势种类的比例;在护料的养护下,原生动物的物种丰富度明显增加,第60天(D60)时各处理的平均密度、种类数量及多样性指数均表现为处理1>处理3>处理2>处理4;鱼体存活率大幅提高,各组存活率依次为处理1(85.7%)>处理2(57.1%)>平均数(50.0%)>处理4=处理3(28.6%),其中,对水质要求高的鳙鱼在处理1、处理2中均有1尾存活。【结论】运用护料中具有区域属性的微生物菌群,并随养殖时期调整护料C/N比,可养护池塘使养殖系统动态稳定,保持健康养殖。

基于响应面法的维氏气单胞菌灭活疫苗菌液发酵工艺优化及免疫效力比较

为优化维氏气单胞菌Aeromonas veronii灭活疫苗菌液发酵工艺,通过单因素试验确定温度、培养基初始pH、转速、接种量对菌液活菌数的影响,应用响应面法的Box-Behnken进行优化,对不同发酵条件下发酵菌液制备灭活疫苗的安全性及免疫效力进行了比较。结果表明:当最优发酵条件为温度28℃、培养基初始pH 7.5、摇床转速230 r/min、接种量5%时,维氏气单胞菌CA07株发酵获得最大的活菌数为11.13×10^(9) CFU/mL,较单因素试验确定的最高活菌数值提高20.59%,与预测值基本相符;优化发酵条件能提升发酵菌液活菌数,从而显著提高制备的灭活疫苗的相对免疫保护率,即使制备的灭活疫苗稀释3倍,免疫鲫鱼Carassius auratus的相对保护率仍可达到70%以上,以维氏气单胞菌LY02株攻毒,相对免疫保护率达40%以上。研究表明,通过响应面法优化维氏气单胞菌灭活疫苗发酵工艺,在显著增加菌液产量的同时可提高疫苗的免疫效力。