一种基于HDR-CRISPR/Cas9技术快速构建重组鸭肠炎病毒的方法的建立

[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。

关于词语释义的几个问题

词语解释具有很强的科学性,词语解释与词语结构之间有密切的联系,准确地进行词语释义对学习语言十分重要,因此,必须划清"四个界限"、弄清"一个关系"、认准"一个对象"。

PAAS对堆肥产品保肥作用的初步研究

采用以聚丙烯酸钠(PAAS)为调理剂的堆肥产品进行小白菜盆栽实验,研究PAAS堆肥调理剂对堆肥产品的保肥研究.初步研究结果表明:使用添加了PAAS的堆肥产品,小白菜株高更高,茎粗更粗,叶绿素、N、P、K等养分含量较高,PAAS的高吸水、保水和保氮性能改良土壤,使小白菜生长得更好.

创新管理模式 助推提质增效——以某市政公司工程项目区域管理为例探讨管理模式创新

当今的社会经济在不断的发展,建筑行业市场也在不断紧跟着发生变化,虽然在跟随社会经济发展的脚步时企业得到了可观的发展,但也面临许多经营管理困难和难题,企业管理控制难、项目管理不合理等问题越来越突出,而我国建筑行业同质化比较严重,行业内竞争又日益激烈,因此,每个建筑施工企业的经营管理模式和方法不能墨守成规,必须与时俱进,才能在市场中立于不败之地。实践中,经营管理的创新有很多种,诸如:管理组织的创新、管理方式的创新、管理目标的创新、管理对象的创新等等,本文通过分析中铁某集团市政工程有限公司(以下简称市政公司)在工程项目区域管理上的做法和效果,说明管理模式创新对企业发展的积极作用。

长管棚在浅埋软弱隧道中的应用

长管棚施工是隧道施工中对隧道前方围岩进行超前预支的主要措施之一,在软弱浅埋段地层施工申得到了广泛应用.从施工长管棚后的开挖效果看,采用长管棚进行超前预支护,对隧道施工安全与进度都较有利,施工质量好、工期短,经济效益、社会效益显著,为浅埋炭质页岩软弱地层隧道施工提供了一定的经验.

丝竹之音,为心灵添一抹亮色

竹笛是我国较早出现的民族乐器之一,由于其构造简单、音色明亮圆润、演奏技巧丰富,颇具艺术表现力,深受人们的喜爱。我园充分利用地理优势和周边古文化民族特色,结合"育竹"特色课程,选择以竹笛为艺术切入口,以幼儿竹笛吹奏为载体,成立竹笛社团,借以体验竹笛文化的精髓,挖掘竹文化的内涵。

视角·人称·结构——论陈染《私人生活》的思辨性形式表征

《私人生活》是陈染最重要的作品之一,也是20世纪90年代女性文学的代表性文本。自问世以来,学界不断从女性意识、私人化写作、叙事策略等角度探究这部作品,研究成果颇丰,一定程度上揭示了其意蕴的丰富性与形式的独特性,但该作的内在特质尚未被充分挖掘,思辨性就是其一。这部小说借助对女性个人生命体验的描绘,揭示两性关系的错位纠结、个体与群体的内在紧张感等,从而带有鲜明的思辨意味。这种思辨性不只体现在语言、意象等层面,还投射在其叙事形式的选择上。

超早期康复护理对脑卒中患者功能恢复的效果评价

目的:探析超早期康复介入护理干预对脑卒中患者功能恢复及生存质量的影响,为今后脑卒中患者护理方案的制定和实施提供参考和借鉴。方法:选择绍兴市上虞人民医院2012年1月-2013年6月期间神经内科收治的确诊为脑卒中的首发患者160例为研究对象,采用前瞻性平行对照组法并随机抽签分为实验组和对照组组,每组80例,对照组行常规护理,实验组组在此基础上超早期(48h内)行康复介入干预护理。经6个月随访,对比两组患者心理状况、日常生活活动能力、生存质量变化情况。结果:实验组抑郁发生率为51.25%,低于对照组的66.25%,且实验组抑郁严重程度低于对照组(χ2=9.0281,P=0.0289);实验组生活基本自理率为100.00%,高于对照组的76.25%,差异有统计学意义(χ2=21.5603,P=0.0000);两组患者护理后BMI评分较护理前明显升高,实验组升高程度更为显著,差异具有统计学意义(P<0.05);两组患者干预后和干预前SIS评分比较均明显升高(P<0.05),实验组升高程度和对照组比较更为显著(P<0.05)。结论:超早期全方位、针对性的康复介入干预护理能有效促进患者神经功能的恢复,降低卒中后抑郁的发生率和严重程度,提高患者日常生活自理能力,达到改善患者生存质量的护理目的,值得在临床中广泛推广和应用。

精细化管理在神经内科护理管理中的应用

目的：探讨精细化管理在神经内科护理管理中的应用效果。方法：将2013年8~12月实施精细化管理前的276名住院患者为对照组,将2014年1~5月实施精细化管理后的276名患者为观察组,采用自制量表和调查问卷的方式,评价实施前后护理人员的护理质量和患者满意度等。结果：实施精细化管理后,神经内科的护理质量和患者满意度均明显提高（P〈0.05）。结论：神经内科护理管理采用精细化管理,可有效提高护理质量,提高患者满意度,提高护理管理效益。